硅藻18S rRNA鉴别实验家兔水中尸体死因的研究

周玉倩

工作单位：210042江苏省南京市东南司法鉴定中心



硅藻18SrRNA鉴别实验家兔水中尸体死因的研究

周玉倩

工作单位：210042江苏省南京市东南司法鉴定中心

【摘要】目的 利用硅藻18S rRNA基因检测判定实验家兔水中尸体的死亡原因。方法 将实验家兔随机分成溺死组（n=12）、死后抛尸入水组（n=12）及空白对照组（n=6）。各组按实验设计分别提取死后家兔的肺、肝、肾、脑组织和心血，匀浆后，选用硅胶密度梯度离心法分离组织中的硅藻并采用Chelex-100法提取硅藻DNA，运用PCR技术扩增硅藻特异的18S rRNA基因片段。结果 溺死组肺、肝、肾、脑组织及心血中硅藻检测多数呈阳性：肺（100%）、肝（75%）、肾（83%）、脑（66.7%）、心血（58.3%）；死后抛尸入水组仅在肺组织和肾组织中各检出2例和1例阳性；空白对照组各组织全部呈阴性。结论 将PCR技术扩增硅藻18S rRNA基因片段运用到家兔水中尸体的死亡原因判断，其灵敏度和特异性均优于传统的硅藻强酸消化法。此检测方法对水中尸体的死因鉴定具有一定的应用前景。

【关键词】硅藻18S rRNA；PCR扩增；水中死亡；死因鉴定

溺死（death by drowning）是由于液体机械性的阻塞呼吸道及肺泡，阻碍气体交换，导致体内缺氧、二氧化碳潴留，而发生的窒息性死亡［1］。水中尸体的死因鉴定一直是法医鉴定中的热点亦难点之一。法医学实践中硅藻检验法仍是目前鉴定水中尸体死因相对可靠且最为常用的诊断方法［2-3］。随着分子生物学的发展，部分学者尝试通过扩增浮游生物DNA序列的方法检测硅藻，并将其用于水中尸体的死因鉴定［4-7］。本文尝试通过PCR扩增得到硅藻18S rRNA片段，并研究硅藻18S rRNA在水中尸体死因鉴定中的应用价值。

1　材料与方法

1.1实验分组和动物模型制作

大白兔30只随机分成三组，分别为溺死组（n=12）、死后抛尸入水组（n=12）和空白对照组（n=6）。将溺死组实验动物置于笼中锁紧并系上长绳，沉入江水约0.5 m深处，停留1 min后提出水面，30 s后重新沉入相同深度水中，重复该步骤2～3次后，将家兔沉入水中直至溺死，在水中浸泡5 h后取出；将死后抛尸入水组实验动物以钝性闭合性脑外伤处死后，尸体置于笼中锁紧并系上长绳沉入溺死组相同深度同水域，浸泡5 h后取出。对照组则将实验动物以钝性闭合性脑外伤处死后不做任何处理。同时收集溺死地点相同水深处的水样各15 ml编号放入Ep管内。

1.2检材制备

在处理实验动物之前，先将实验所需全部器械用超纯水冲洗浸泡。将各组实验动物尸体用单蒸水反复冲洗后，移至超净工作台上，打开胸腹腔后用一次性注射器从左心抽取心血并转移至干净的Ep管中。用超纯水反复冲洗各内脏表面后提取肺、肝、肾组织，最后打开颅腔提取脑组织，亦用超纯水冲洗表面。取肺、肝、肾、脑组织各2 g放入已经超纯水冲洗浸泡的玻璃匀浆器内，加入少量超纯水后进行充分匀浆，将匀浆好的组织液倒入洁净的Ep管中。

1.3硅藻的分离及提DNA提取

根据何方刚等［6］报道的方法，将肺、肝、肾、脑组织的组织匀浆液及心血各5 ml分别转移至20 ml离心管（BECKMAN，American）中，各加入8 ml Percoll®溶液（Aersham Biosciences，Sweden）并充分混匀，配平后对称放入高效离心机（BECKMAN，American）内，12℃ 17000 rpm离心60 min。弃上清并向下层液体中加入2倍体积超纯水，充分混匀后12℃ 6000 rpm 离心15 min。弃上清并向下层沉渣中加入10 ml超纯水，充分混匀后12℃ 12000 rpm离心10 min。弃上清保留沉渣。取水样2 ml，12000 rpm条件下离心10 min，弃上清并向沉淀内加入等体积超纯水，充分震荡后12000 rpm离心5 min，弃上清保留沉渣。向各组织及水样沉渣中分别加入200 μl 10% Chelex-100溶液，﹣80℃冰冻30 min，取出后立即放入56℃水浴锅中解冻，5 min后从水浴锅中取出，再次放入﹣80℃冰箱中冰冻30 min，重复冻融3次后按常规Chelex-100法提取硅藻DNA。

1.4PCR扩增及产物检测

采用J Zimmermann［8］等报道的引物扩增硅藻18S rRNA，引物序列见表1，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1　扩增硅藻18S rRNA的引物序列

PCR反应总体系为25 μl，内含200 μmol/L dNTPs溶液2 μl，10×buffer缓冲液2.5 μl （包含100 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，10mmol/L Tris-HCl（pH8.3）），5 U/μl Taq®DNA聚合酶1.25 μl（以上产品均由日本Takara Bio株式会社提供），上、下游引物各0.5 μl（浓度均为20 μmol/L），模板DNA 4 μl ，以及灭菌蒸馏水14.25 μl。PCR循环参数为：94℃ 2 min，然后94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 1 min，共40个循环，再72℃延伸10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后溴化乙锭显色。

1.5强酸消化法

分别取用肺、肝、肾被膜下组织10～20 g，使用常规强酸消化法制得沉渣悬液后封片镜检。

2　结果

2.1硅藻18S rRNA检测结果

引物对D512for 18S和D978rev 18S扩增的产物大小约为400 bp,琼脂糖凝胶电泳结果见图1。溺死组大多数动物内脏组织均检测出硅藻18S rRNA扩增产物；死后抛尸入水组仅在肺组织和肾组织中各检出1例阳性；对照组各组织均无扩增产物，各组具体结果见表2。

2.2强酸消化法硅藻检测结果

溺水地点所取水样中主要含有的藻类有直链藻、舟形藻、针杆藻、曲壳藻，以及小环藻、菱形藻、布纹藻卵形藻等，硅藻大小7 μm～1 mm不等。

溺死组肺组织中含有溺死点水样中的大多数种类的硅藻，如直链藻、舟型藻、针杆藻、曲壳藻等，硅藻大小多为10～20 μm；肝和肾组织中所见的硅藻种类很少（1～3种），如针杆藻、舟型藻等。各组中肺、肝、肾组织的硅藻检测结果见表3。

表2　各组18S rRNA 产物的阳性数和阳性率

表3　各组织强酸消化法硅藻检验阳性数和阳性率

3　讨论

3.1硅藻18S rRNA PCR检测在溺死鉴定中的应用价值

本文选择J Zimmermann设计的引物，其扩增产物所含多态性信息丰度较高，利于硅藻种群分析。本实验中，从溺死地点所取得的水样均检出硅藻，而以双蒸水为样本的阴性控制对照无扩增产物（图1）。表明通过检测硅藻18S rRNA基因片段进行溺死鉴定在方法学上是可靠的。本研究溺死组12例中肺组织全部检出硅藻18S rRNA基因片段（100%）。肝和肾组织中检测的阳性率分别为75%和83%，而强酸消化法的阳性率则分别为25%和16.7%，对两两进行检出率卡方检验结果显示：肝组织中两种硅藻检验方法具有统计学意义（0.01＜P＜0.05）;肾组织中两种方法具有高度统计学意义（0.001＜P＜0.01）。同时，硅藻18S rRNA在脑组织和心血中的检出率分别为66.7%和58.3% 。单从检出率看，本实验中肺、肝和肾组织的检出率略高于以往报道的硅藻检出率（肺96%、肝78%、肾67%）［9］；而脑组织和心血的检出率相对于传统的硅藻检验而言，呈明显提高。且实验运用PCR技术检测溺死尸体组织中的硅藻18S rRNA序列，其灵敏度要远高于传统硅藻检验法。本实验中，取2 g动物组织或2 ml心血进行检测，即可得到明确的阳性结果，而传统的硅藻检验一般需约20 g以上的组织。本实验中心血的硅藻阳性检出率相较于其他组织而言则相对偏低，可能是由于溺死后并经过长时间浸泡的家兔心血凝固现象明显，可获得的心脏内血液量很少，故导致其检出率相对较低。

3.2强酸消化法在硅藻检测中的应用价值

使用强酸消化法进行硅藻检验，能够直观的从形态学上对藻类进行数量分析和种类鉴别，并借助硅藻丰度、Kater分离值、种群指数和优势指数等指标进行分析，帮助推断溺水地点。应用本实验中的PCR方法虽可以极大提高硅藻检测灵敏度，但无法确定藻类数量及进行硅藻种类的比对。

图1　溺死组（A）和对照组（B）不同组织硅藻18S rRNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果M：50 bp DNA Ladder；1：溺死点水样；2～6：肺、肝、肾、脑组织和心血；7：阴性对照

参考文献

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［8］Jonas Zimmermann，Regine Jahn，Birgit Gemeinholzer.Barcoding diatoms：evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene，including new primers and protocols［J］.Organisms Diversity & Evolution，2011，11（3）：173-192.

［9］陈煌，周安居.498例水中尸体硅藻检验分析［J］.中国法医学杂志，2006（s1）：23-24.

A Study on Detecting Diatom 18S rRNA Genes to Identify Cause of Death by Drowning on Rabbits

ZHOU YuqianNanjing Southeast Forensic Service in Jiangsu province，Nanjing 210042，China

【Abstract】

Objective To evaluate the value of detecting the diatom 18S rRNA genes in the identification of drowning death in rabbits.Methods The experimental rabbits were randomly divided into groups drowning （n = 12），after the death of the dead bodies into the water group （n = 12）and control group （n = 6）.Each group according to the experimental design were extracted after death rabbit lung，liver，kidney，brain and effort，homogenized，use silica density gradient centrifugation organization diatoms and extracted using Chelex-100 diatom DNA，PCR amplified using diatom-specific 18S rRNA gene fragment.Results For drowning group，the specific amplification products of 18S rRNA gene were detected from most kinds of tissues from drowning group ：lung （100%），liver （75%），kidney （83%），brain （66.7%）and heart blood （58.3%）.For postmortem submersion group，however，only two cases were detected from lung tissues and one case was detected from kidney tissues respectively.No amplified products were positive in various tissues in control group.Conclusion The detection rate of the 18S rRNA gene with PCR-based method developed by this study was higher than the traditional method of diatom with strong acid digestion method in drowning victims.Both of the sensitivity and specificity of this method were superior to traditional methods，and it can be used as a potentially useful tool to identify cause of death by drowning.

【Keywords】Diatom 18S rRNA，PCR，Death by Drowning，Identify Cause of Death

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2015.12.018

【中图分类号】D919.4

【文献标识码】A

【文章编号】1674-9316（2015）12-0023-03