一株香蕉内生细菌挥发油成分及抑菌活性研究

刘先宝+蔡吉苗+陈奕鹏+李超萍+黄贵修

摘 要 测定一株香蕉内生细菌BEB99发酵液的石油醚和乙酸乙酯粗提物对香蕉枯萎病菌4号生理小种的（FOC4）菌丝生长和孢子萌发的影响，并测定粗提物中的主要成分。研究结果表明：其发酵液的石油醚和乙酸乙酯粗提物对香蕉枯萎病菌的菌丝生长和孢子萌发均具有明显抑制作用，可造成病菌菌丝的畸形，抗菌物质浓度为1.67 mg/mL时，其孢子萌发抑制率分别达到92.99%和82.96%。GC/MS分析从粗提物中鉴定到18个成分，其中主要成分包括油酸（14.98%）、油酸乙酯（11.38%）、亚麻油酸乙酯（14.86%）、亚油酸（13.20%）、棕榈酸（11.36%）和棕榈酸乙酯（11.26%），及一个未知化学成分。

关键词 内生细菌 ；尖孢镰刀菌 ；挥发油 ；抑菌活性

分类号 S453.121

Volatile Oil Constituents and Antimicrobial Activity of

Endophytic Bacteria Isolated from Banana

LIU Xianbao CAI Jimiao CHEN Yipeng LI Chaoping HUANG Guixiu

（Environment and Plant Protection Institute / Ministry of Agriculture Key Laboratory of

Integrated Pest Management on Tropical Crops / Hainan Key Laboratory for Monitoring and

Control of Tropical Agricultural Pests， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China）

Abstract The petroleum ether and ethyl acetate crude extracts of endophytic bacteria strain BEB99 were got by solvent method， and were tested by agar disc diffusion method for their antimicrobial activities against Fusarium oxysporum （FOC4）. The results revealed that the crude extracts displayed strong inhibitory effect on the mycelial growth and spore germination of FOC4. The pathogenic hyphae grew in abnormal shape and produced sac. The inhibition rate of spore germination were 92.99 % and 82.96% respectively when the concentration of petroleum ether and ethyl acetate crude extracts reach to 1.67 mg/mL. Nineteen ingredients were identified from the petroleum ether crude extract of BEB99 by GC-MS analysis. The relative content of Oleic acid （14.98%）， Ethyl oleate （11.38%）， Linoleic acid （13.20%）， Ethyl linoleate （14.86%）， Palmitic acid （11.36%） and Ethyl palmitate （11.26%） were main composition.

Keywords endophytic bacteria ； Fusarium oxysporum ； volatile oil ；antifungal activities

由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cubense，FOC） 侵染引起的香蕉枯萎病是危及香蕉产业发展的毁灭性病害。目前，生产上还未建立对香蕉枯萎病有效的防治方法。结合运用农业防治、生物防治等方法对香蕉枯萎病进行综合防控已成为国内外的研究热点[1]。

植物内生细菌是指存在于植物体内或生活史的某一特定阶段，存在于植物体内而未引起明显症状的细菌[2]。香蕉植株中存在丰富的内生菌资源[3-4]，内生细菌可通过固氮、溶磷、产铁载体、产生长素等特性促进植物生长，还可通过占据生态位、代谢产物抑制病原菌生长或诱导植物抗性等防治病害危害，在植物病害的防治方面有着很好的应用前景[5-8]。本实验室在前期研究工作中从香蕉根中分离到一株内生细菌，经形态和分子鉴定其为劳尔氏菌，盆栽实验发现，该菌株具有一定促生和生防作用。本研究在此基础上，以香蕉枯萎病菌作为靶标菌，通过平板检测分析内生细菌挥发油成分对病原菌菌丝生长和孢子萌发的影响，通过GC-MS技术分析其挥发油的化学成分。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

香蕉内生细菌BEB99和香蕉枯萎病病菌尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（FOC4），均由本实验室分离和保存。

1.1.2 培养基和试剂

NA培养基、优化培养基（4 g/L葡萄糖，1 g/L酸水解酪蛋白，0.5 ml/L的1 mol/L MgCl2，1 ml/L的1 mol/L CaCl2，pH 6.5）、PDA、PD培养液、石油醚、乙酸乙酯。

1.2 方法

1.2.1 BEB99菌株发酵液制备

将保存的内生细菌BEB99菌株接入优化平板培养基中，28℃，24 h进行活化。将活化的BEB99菌株接入50 mL优化的液体培养基中（150 mL三角瓶），28℃，180 r/min振荡培养36 h，制成种子液，再将种子液以7 %的接种量接入优化培养液中，相同条件下培养36 h，制备BEB99菌株的发酵液。

1.2.2 BEB99菌株发酵产物分离

将浓缩的发酵产物用细胞超声破碎仪破碎后，分别用石油醚、乙酸乙酯有机溶剂250 mL与发酵液等体积混合，在1 000 mL分液漏斗中反复颠倒振荡30 min，使其萃取充分，静止过夜，萃取3次，合并有机相，将有机相减压浓缩成浸膏，用石油醚、乙酸乙酯溶剂定容，备用。

1.2.3 BEB99菌株发酵产物抑菌活性测定及其对菌丝生长影响

将FOC4在PDA平板上培养5 d，用无菌水洗下分生孢子，后用灭菌的纱布过滤除去菌丝体，配成浓度为1×107个/mL的孢子悬浮液。待PDA培养基冷却至50℃，吸取孢子悬浮液与培养基以1：9的比例混匀后倒入培养皿制成带菌平板。分别将石油醚、乙酸乙酯提取物稀释至浓度为25 mg/mL，再将25 mg/mL的石油醚、乙酸乙酯提取物稀释1、10、20和30倍，各取20 μL滴到灭菌的滤纸片（直径9 mm）上。待吹干后放置带菌平板中央，重复3次，以滴加石油醚和乙酸乙酯有机溶剂为对照，28℃培养，5 d后观察滤纸片周围有无抑菌圈及其大小。同时用解剖刀切取抑菌圈边缘的菌丝置于载玻片上，以正常培养生长的菌丝为阴性对照，以含多菌灵培养基上培养的菌丝为阳性对照，在光学显微镜下观察菌丝形态变化。

1.2.4 BEB99菌株发酵产物对FOC4菌株孢子萌发影响测定

抑制孢子萌发作用的测定采用悬滴法。分别取25 mg/mL的石油醚、乙酸乙酯相提取物5、10、15、20 μL到2 mL已灭菌的离心管里，待石油醚和乙酸乙酯溶剂挥干，分别用75 μL无菌水溶解，使提取物浓度分别为1.67、3.33、5.01、6.68 mg/mL。将FOC4孢子悬浮液与不同浓度的提取物等量混合，混匀后吸取20 μL滴加到水琼脂上（水琼脂事先滴在玻片上），待干后将玻片倒置放在垫有湿润滤纸的培养皿中，置25℃条件下保湿培养8 h，统计10个视野中总孢子数和萌发孢子数，计算孢子萌发抑制率。3次重复，以等量无菌水与孢子悬浮液混合为对照。

孢子萌发抑制率（%）=（对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率×100。

1.2.5 BEB99菌株发酵产物挥发油化学成分测定

挥发油化学成分通过美国安捷伦公司GC/MS联用仪（HP6890/HP5975C）进行测定。色谱柱为AB-INowax（30.0 m×250 μm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，柱温50℃（保留2 min），以5℃/min升温至230℃，保持20 min；汽化室温度250℃；载气为高纯He（99.999%）；柱前压5.08 psi，载气流量1.0 mL/min；进样量1 μL（乙醚溶液）；分流比20∶1。质谱条件：离子源为EI源，离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 022 V；接口温度280℃；质量范围20～450 amu。

2 结果与分析

2.1 BEB99菌株发酵产物分离

本研究共收集内生细菌BEB99发酵液80 L，减压浓缩破碎后，分别用等体积的石油醚和乙酸乙酯有机溶剂萃取得石油醚相提取物0.1 g，乙酸乙酯相提取物9 g。

2.2 BEB99菌株发酵产物抑菌活性

以香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（FOC4）作为靶标菌，采用滤纸片扩散法对不同浓度梯度的提取物进行抑菌活性检测。实验结果表明，各浓度梯度的挥发油对靶标菌表现出不同程度的抗菌活性。随着稀释梯度的增大，抑菌圈减小，稀释1、10倍的石油醚和乙酸乙酯相提取物对香蕉枯萎病菌菌丝均有抑制作用，但稀释20倍的石油醚相提取物对香蕉枯萎病菌菌丝还具有一定抑制作用，而该浓度的乙酸乙酯相提取物对香蕉枯萎病菌菌丝则无抑制作用，在稀释达到30倍时均无抑制作用，见图1。

2.3 BEB99菌株发酵产物对FOC4菌丝生长的影响

挑取抑菌圈临界处的菌丝在光学显微镜下观察，并以多菌灵为阳性对照和生长良好的香蕉枯萎病菌菌丝为阴性对照，可见受抑制的菌丝变形扭曲，新分支处菌丝生长受抑制，隔膜处缢缩，原生质凝聚，而生长正常的菌丝生长茂盛，菌丝伸展良好，形态均匀，直长，光滑（如图2）。

2.4 BEB99菌株发酵产物对FOC4菌株孢子萌发的影响

实验结果表明，菌株BEB99提取物对香蕉枯萎病菌分生孢子也具有明显的抑制作用，并且随着抗菌物质浓度的提高而增强。分生孢子经浓度为1.67 mg/mL的石油醚、乙酸乙酯相提取物处理8 h后，孢子萌发抑制率分别为92.99 %和82.96%。当抗菌物质浓度达到5.01 mg/mL以上时，孢子萌发抑制率均高达100%（表1）。

2.5 BEB99菌株发酵产物挥发油的化学成分

应用GC-MS技术，对菌株BEB99的挥发油进行成分分析，并通过归一化法确定各成分的相对百分含量（表2）。共得到19个色谱峰（图3），鉴定出18个成分，还有一个未知化学成分，占总油量的97.958%。菌株BEB99挥发油中的组分复杂多样，以酯类、酸类化合物为主，其中酯类6种，酸类9种，醛类2种。相对含量超过10%的有油酸（14.98%）、油酸乙酯（11.38%）、亚麻油酸乙酯（14.86%）、亚油酸（13.20%）、棕榈酸（11.36%）和棕榈酸乙酯（11.26%）。

3 讨论与结论

目前，有关植物内生细菌的挥发油成分及其抑菌活性研究报道较少。本研究运用 GC- MS 联用技术分析并鉴定出18个成分，其中以油酸、油酸乙酯、亚麻油酸乙酯、亚油酸、棕榈酸和棕榈酸乙酯为主，还有一个未鉴定出的化学成分，挥发油粗提物对香蕉枯萎病菌具有很好的抑菌活性。

据相关文献报道，柠檬酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸及亚油酸等有抑制细菌和真菌生长的作用。Walters等[9]的研究发现，油酸、亚油酸和亚麻酸能抑制Rhizoctonia solani、Pythium ultimum、Pyrenophora avenae 和Crinipellis perniciosa等重要植物病原真菌的生长。Liu等[10]研究发现，棕榈酸、油酸及亚油酸等有机酸不仅对植物病原菌Alternaria solani、Colletotrichum lagenarium、Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum 和Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici的菌丝有抑制作用，还对孢子萌发有抑制作用。马妙莲等[11]从小米中分离到一株戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus），其代谢产物对黄曲霉、革兰氏阳性菌、阴性菌具有较强的抑制作用，分析发现，发酵液含有棕榈酸、油酸、硬脂酸、亚油酸、乙酸、乳酸、琥珀酸和柠檬酸等多种抑菌成分。在抑菌机制方面，Tyler等[12]研究表明，Pseudozyma flocculosa菌产生的孢外脂肪酸可嵌入菌体中，通过破坏细胞膜结构和裂解细胞，抑制植物白粉病菌的生长。有关本研究的抑菌有效成分及抑菌机理有待进一步研究。

参考文献

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