平陆百合脱毒试管苗鳞片的分化研究

2016-01-14殷丽娜,任建宏,赵娟等

山西农业大学学报（自然科学版） 2015年6期

平陆百合脱毒试管苗鳞片的分化研究

殷丽娜，任建宏，赵娟*，王玉国，席丛林，尹美强，温银元，王育选

(山西农业大学农学院山西太谷 030801)

摘要：以平陆食用百合脱毒试管苗的鳞片为外植体，研究了不同接种部位和方式，不同植物激素种类和浓度对鳞片分化的影响。结果表明：平陆百合鳞片的分化能力为外层>中层>内层，同一鳞片的不同部位分化能力为下段>中段>上段。接种方式以鳞片竖直插入培养基中为好，鳞片分化快，分化率高。试验中设置的培养基均可诱导鳞片分化，但附加不同种类和浓度的激素对鳞片分化出的小鳞茎的数量和生长状况影响不同，差异很大。其中以培养基MS+6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1上诱导出的小鳞茎数量多，生长壮，适宜作为快繁时获取大量鳞茎的培养基；在培养基MS+ZT 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1和MS+ZT 1.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1上诱导出的小鳞茎数量不多，但生长健壮，可直接成苗，适宜作为诱导鳞片分化较大鳞茎的培养基；诱导鳞片分化愈伤组织的最适宜培养基为MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1，愈伤组织不经转换培养基可直接分化鳞茎。

关键词：平陆百合；鳞片；分化

收稿日期：2015-08-04修回日期：2015-09-18

作者简介：殷丽娜(1990-)，女(汉)，山西朔州人，硕士研究生，研究方向：植物组织培养

通讯作者：*赵娟，博士，副教授，硕士生导师。Tel：13834836658；E-mail:sxndzhaojuan@163.com

基金项目：山西省科技攻关项目(20130311014-1) ；山西农业大学引进人才科研启动项目(2012YJ13)

中图分类号：S644.1文献标识码：A

Differentiation of the Virus Free Scale ofLiliumbrowniivar.viridulum

Yin Lina, Ren Jianhong, Zhao Juan*, Wang Yuguo, Xi Conglin, Yin Meiqiang, Wen Yinyuan, Wang Yuxuan

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

Abstract:Using the test tube flake seedings of Lilium brownii var. viridulum as explants, we studied different inoculation sites and methods, the effect of different plant hormones species and concentrations on the differentiation of scales. The results showed that: The differentiation ability of Scale in Lilium brownii var. viridulum was: Outer > middle > inner layer, the ability to different parts of the same scale was: Upper> middle> section and the vertical scale inserts the culture medium, the differentiation and differentiation rats were the best. The Experiment seted all of the medium that could induce the differentiation of scales. The number and growth status of the small bulbs which were differentiated from the scales were differed greatly, because of the different kinds and concentrations of hormones. MS+6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1 was induced the large number of small bulbs, growth and strong, the medium was suitable for the development of a large number of bulbs in the rapid propagation. The number of small bulbs induced by MS+ZT 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1 and MS+ZT 1.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1 was not much, but strong greatly and directly seeding, suitable as a medium for inducing the differentiation of the larger bulbs. The most suitable medium was MS+2,4-D1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1 which induced scale differentiation of callus, the callus without conversion medium direct differentiation of the bulb.

Key words:Liliumbrowniivar.viridulum; Scales; Differentiation

平陆百合是百合科百合属多年生草本球根植物，含丰富蛋白质、脂肪、淀粉、维生素，及少量钙、磷、铁等，食用价值高，具有补中益气，温肺止咳，安神、清心之功效。近年来随着国内外市场需求扩大，平陆百合的生产和消费逐年增加。传统繁殖方法繁殖系数低，经过多代繁殖以后，常常会造成种性退化和病毒积累，从而影响百合的产量和质量。

利用植物组织培养技术繁殖百合可以有效去除病毒，在短期内提供大量优质百合种球，弥补种球繁殖的不足，是百合进行商品化以及产业化发展的必然趋势[1]。目前关于食用百合的多数研究集中在宜兴百合[2，3]、兰州百合等[4，5]，尚未见到平陆百合组织培养的相关报道。本试验以平陆百合脱毒试管苗鳞片作为外植体，研究不同激素浓度、配比对外植体分化和增殖的影响，为平陆食用百合快速繁殖规模化生产提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

平陆食用百合(Liliumbrowniivar.viridulum)脱毒试管苗由山西农业大学农学院植物组织培养实验室提供。

1.2试验方法

1.2.1接种部位和接种方式选择

以平陆百合脱毒试管苗的鳞片为外植体，由外向内剥离鳞片，分别将每块鳞片切割成上、中、下3段，以竖直插入和平铺放置2种方式接种，共18个处理(表1)，每个处理接种24个鳞片，重复3次。接种于附加6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1的MS培养基上，7 d后开始观察其分化情况，30 d后统计鳞片的分化率和发生分化的鳞片上小鳞茎的分化数。

1.2.2培养基与激素种类水平设置

本试验所用培养基均以MS培养基为基本培养基，附加蔗糖100 g·L-1，琼脂6 g·L-1，调节pH值至5.6～5.8，121 ℃高压灭菌20 min。培养温度(25±2) ℃，光照14 h·d-1，光照强度1 000～2 000 lx。

以平陆百合脱毒试管苗的鳞片为外植体，切割后接种于附加不同植物激素的MS培养基中,具体激素种类水平设置详见表2～表5。7 d后每天观察其分化生长及污染情况，30 d后统计鳞片分化率及分化情况。

1.3数据统计及分析方法

鳞片分化率=发生分化的鳞片数/接种鳞片数×100%；增殖倍率=分化出的小鳞茎数/发生分化的鳞片数；愈伤组织诱导率=分化愈伤组织的鳞片数/接种鳞片数×100%

试验采集的数据均由DPS 7.05软件进行数据分析。

2结果与分析

2.1不同接种部位及接种方式对鳞片分化的影响

由表1可见，不同鳞片片层，不同接种部位及不同接种方式对鳞片的分化有较大影响。外层鳞片和中层鳞片的分化能力明显大于内层鳞片。同一鳞片的上段分化能力最差，中段较好，下段最强，且鳞片下段的分化率明显高于中上段。方差分析结果显示，表1中的18组处理之间差异显著(p<0.05)；以A3的分化率最高，即外层鳞片，其下部在竖直放置接种时，比平铺放置的鳞片分化快，且分化率达100%(图1、图2)。故对平陆百合的鳞片进行培养时，选用外层下段作为外植体最佳，且以竖直放置接种分化快，分化率高。

2.2不同激素对鳞片不定芽分化及增殖的影响

2.2.16-BA与NAA配比对鳞片分化及增殖的影响

由表2可见，6-BA和NAA 浓度由低到高的变化过程中，鳞片分化率以及增殖倍率呈现阶段变化的趋势。方差分析结果可得，在不同浓度的6-BA和NAA处理下，分化率与增殖倍率这两个生长指标变化一致。表2的9组处理在分化率及增殖率上差异显著(p<0.05)，其中B5培养基的差异显著高于其他8组，即附加6-BA 0.8 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1时，鳞片诱导分化最快，增值率最高，分别为96%和7.5倍，分化出的小鳞茎增殖快，长势健壮。故在MS培养基中附加6-BA 0.8 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1适宜作为平陆百合快繁时鳞茎大量增殖的诱导培养基。

2.2.2ZT与NAA配比对鳞片分化及增殖的影响

由表3可见，附加不同浓度ZT和NAA，对百合鳞片分化与增殖的影响不同，差异明显。对统计数据进行方差分析，在不同浓度的6-BA和NAA处理下，分化率与增殖倍率这两个生长指标变化几乎一致，结果可得，表3中9组处理在分化率及增殖率上都差异显著(p<0.05)。其中C6培养基的差异显著高于其他8组，即附加ZT 1.0 mg·L-1和NAA 0.2 mg·L-1时，鳞片分化率达100%，增值率为1.91倍，分化出的小鳞茎长势特别健壮，可直接成苗。故在MS培养基附加ZT1.0 mg·L-1和NAA0.2 mg·L-1，适宜作为诱导鳞片分化较大鳞茎的培养基。

表1　不同接种部位及接种方式对鳞片分化的影响

注：同列不是小写字母表示差异显著(p<0.05)。下同(表2～表5)。

Note：Different lowercase letters show significant difference at the 0.05 level in the same column,respectively(Table 2～5).

图版　Ⅰ　1.鳞片竖直插入接种；2.鳞片平铺放置接种；3.愈伤组织的诱导:培养基MS+2,4-D1.0mg·L -1+6-BA0.5mg·L -1；4. 鳞片分化小鳞茎:培养基MS+6-BA0.8mg·L -1+NAA0.1mg·L -1；5. 鳞片分化小鳞茎:培养基MS+ZT1.0mg·L -1+NAA0.2mg·L -1；6.鳞片分化小鳞茎:培养基MS+ZT1.5mg·L -1+IBA0.1mg·L -1。 Plate　Ⅰ　Fig.1. Scale vertical insertion；Fig.2. Scale tile placement； Fig.3. The most suitable induce callus culture medium of the scale；Fig.4. Proliferation of the most suitable medium of the scale MS+6-BA0.8mg·L-1+NAA0.1mg·L-1；Fig.5. Proliferation of the medium of the scale MS+ZT1.0mg·L-1+NAA0.2mg·L-1；Fig.6. Proliferation of the medium of the scale MS+ZT1.5mg·L-1+IBA0.1mg·L-1.

处理编号Code6-BA/mg·L-1NAA/mg·L-1接种数Inoculationnumber分化数Differentiationnumber分化率/%Differentiationrate芽增殖总数Totalbudproliferation增殖倍率ProliferationrateB10.50.05251872.0d1065.89dB20.80.05251352.0h614.69hB31.00.0525936.0i283.11iB40.50.10251456.0g735.21gB50.80.10252496.0a1807.5aB61.00.10251768.0e995.82eB70.50.15251560.0f795.27fB80.80.15252288.0b1516.86bB91.00.15251976.0c1166.10c

表3　ZT与NAA配比对鳞片分化及增殖的影响

2.2.3ZT与IBA配比对鳞片分化及增殖的影响

以MS为基本培养基，添加不同浓度的ZT与IBA, 其对百合鳞茎分化与增殖的影响如表4所示。在ZT和IBA 浓度由低到高的变化过程中，鳞片分化率以及增殖倍率没有较明显规律。方差分析可得，分化率与增殖倍率这两个生长指标变化一致，表4中9组处理在分化率及增殖率上都差异显著(p<0.05)，其中D8培养基的差异显著高于其他8组，既在MS培养基附加ZT 1.5 mg·L-1和IBA 0.1 mg·L-1，也适宜作为诱导鳞片分化较大鳞茎的培养基。

2.2.42,4-D与6-BA配比对鳞片分化及增殖的影响

如表5所示，在MS基本培养基中添加不同浓度的2,4-D和6-BA，可诱导百合鳞茎分化愈伤组织。在培养基中附加2,4-D 1.0 mg·L-1、6-BA 0.5 mg·L-1时，百合鳞片愈伤诱导率最高达40%，形成愈伤组织黄白色、颗粒状，不经转换培养基可直接分化百合苗。方差分析可得，表5中9组处理在愈伤诱导率上均差异显著(p<0.05)，其中E2培养基的差异显著高于其他8组，可见MS培养基中附加2,4-D 1.0 mg·L-1、6-BA 0.5 mg·L-1时，为诱导鳞片分化愈伤组织的最适宜培养基。

3讨论

一般认为MS基本培养基较适合百合组织培养，效果较好。较其他培养基如N6、B5等效果好。卢其能[6]以龙牙百合鳞片为外植体研究了MS、White和B5三种培养基对分化效果的对比试验，结果显示MS培养基效果最佳，White培养基效果

表4　ZT与IBA配比对鳞片分化及增殖的影响

表52,4-D与6-BA配比对鳞片分化及增殖的影响

Table 5Effects of 2,4-D and 6-BA on the differentiation and proliferation of scale

处理编号Code2,4-D/mg·L-16-BA/mg·L-1接种数Inoculationnumber出愈数Callusnumber愈伤组织诱导率Callusinductionrate/%E11.00.225728bE21.00.5251040aE31.50.22500gE41.50.52500gE51.51.025520dE62.00.225312fE72.00.525416eE82.01.02500gE92.01.525624b

最差。杨柏云等[7]研究了MS、改良MS和B5液体培养基对切花百合小鳞茎的增殖影响，结果显示MS和改良MS的增殖效果高于B5，两者之间差异不明显。本试验选取MS培养基为基本培养基。

通过不同接种部位对诱导不定芽的影响，得出结论：不同鳞片片层的分化能力外层>中层>内层，同一鳞片片层的不同部位的分化能力为下段>中段>上段，说明外层肥厚的鳞片及其与鳞茎盘连的基部发芽最强，这与丁兰[8]，王刚[9]等的研究结果基本一致。陈丽静等[10]研究表明百合的鳞茎是营养物质的储藏器官和进行无性繁殖的器官，在鳞片的基部，无性繁殖的能力反应最强，即分化小鳞茎的能力最强。试验比较鳞片的不同接种方式对诱导不定芽的影响，得出竖直接种的鳞片比平放接种鳞片有利于分化。原因可能是由于鳞片竖直接种符合植株在形态学上的生长规律。陈丽静等[10]认为植物的极性几乎不会影响到小鳞茎的分化。王刚等[9]认为兰州百合鳞片在培养基上的不同放置方式对百合的诱导也有影响，其诱导分化芽的能力：内侧向上放置>竖直放置>内侧向下平放。这与本试验所得结论竖直接种鳞片比平放接种鳞片更容易分化不定芽一致。

植物激素的种类和比值决定着器官的分化。不同百合品种类型、不同外植体类型和所获取的产物不同，在培养基中附加的生长调节物质的类型和配比也不同。在百合组织培养中较多选用6-BA和NAA配比，诱导鳞片分化增殖，不同品种对激素之间配比的差异较大。本实验选用6-BA与NAA、ZT与NAA、ZT与IBA的配比，研究百合鳞片的分化及增殖。6-BA和NAA配比时，以附加6-BA 0.8 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1，分化率达100%，增殖倍数7.5倍，效果最好。这与刘静[11]、张彦妮[12]等的研究结果相近，与宋建英等[13～15]的实验研究结果不同，这可能与品种之间存在差异，试验条件不同有关。ZT和NAA、ZT和IBA的配比适宜浓度时，分化率可达100%，但增殖倍数较6-BA和NAA配比时低，但分化出的鳞茎生长健壮，可直接成苗。可见，在培养基中附加不同植物激素种类和浓度对鳞片的分化情况有明显影响，诱导分化的鳞茎数量和生长情况差异明显，可根据试验和生产中的具体需求选择不同的培养基培养获得不同的材料。

2,4-D为诱导愈伤组织最常用的植物生长物质，本试验中不同浓度的2,4-D与6-BA配比时，有多组培养基没有成功诱导产生愈伤组织，筛选出较好的诱导愈伤组织的培养基为MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1，诱导率仅达40%，这与邵春昕等[16]西藏卷丹百合愈伤组织诱导率为93%；麝香百合的鳞茎愈伤组织诱导达100%[17]相比，可能是由于品种之间的差异，平陆百合愈伤组织的诱导比其它品种困难，也可能是本试验所设培养基和培养条件问题，还需要进一步试验筛选能够获得较高愈伤组织诱导率的适宜培养基。

参考文献

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