碱性蛋白酶制备高水解度羊骨胶原肽的工艺研究

碱性蛋白酶制备高水解度羊骨胶原肽的工艺研究

甄守艳1，霍乃蕊2，王凯1，程稚玲1，王钰慧1，姚薇1

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801； 2.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801)

摘要：为改善骨胶原的营养和生理功能，优化羊骨粉的碱性蛋白酶水解工艺，制备高水解度的胶原多肽，以邻苯二甲醛法测定水解度，在单因素试验基础上，采用响应面分析法，建立了水解度与料水比(X1)、温度(X2)、时间(X3)、加酶量(X4)的二次多项回归数学模型，方差分析结果表明此模型拟合度高。对模型最优解适当调整，X1、X2、X3、X4分别为9%(W/V)、45 ℃、325 min和4.25%(E/S)，pH9条件下酶解，测得水解度为28.12%，接近预测值28.39%，进一步说明所建模型可靠，可对不同条件下的水解度进行预测，为羊骨的高值化、安全化利用提供理论依据。

关键词：羊骨粉；胶原多肽；碱性蛋白酶；邻苯二甲醛法

收稿日期：2015-07-10修回日期：2015-09-11

作者简介：甄守艳(1988-)，女(汉)，山西五台人，硕士研究生，研究方向：食品生物技术

通讯作者：*霍乃蕊，教授，硕士生导师。Tel：0354-6289236；E-mail：tgnrhuo@163.com

基金项目：国家自然科学基金(31201347)；山西省回国留学人员项目(2014-042)

中图分类号：TS202.3文献标识码：A

Preparation of Sheep Ossein Peptide with High Degree of Hydrolysis by Alcalase

Zhen Shouyan1, Huo Nairui2, Wang Kai1, Cheng Zhiling1, Wang Yuhui1, Yao Wei1

(1．CollegeofFoodScienceandEngineering,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China; 2．CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

Abstract:To improve the nutritional and physiological function of bone collagen, parameters were optimized to prepare ossein peptides with high degree of hydrolysis(DH) by hydrolyzing sheep bone powder with the protease of alcalase. DH was determined by o-phthalaldehyde(OPA) methodology. In light of the results of single-factor experiments, response surface analysis was carried out and a mathematical model was established to describe the DH in response to the levels of bone powder concentration(X1), temperature(X2),time(X3), and the amount of added alcalase.Variance analysis suggested that the model showed high fitting degree. Sheep bone powder was hydrolyzed at pH 9 and under the adjusted optimized parameters of the model, X1、X2、X3、X4 was 9%(W/V)、45 ℃、325 min and 4.25%(E/S)respectively, the determined DH was 28.12%, which was close to the predicted 28.39%.This further confirmed the reliability of the established model which can be used to predict the DH when sheep bone powder was hydrolyzed by alcalase. The results of this study will also provide a theoretical guidance for the high-value and safe utilization of sheep bone.

Key words:Sheep bone powder； Collagen polypeptide； Alcalase； O-phthalaldehyde methodology

我国羊骨资源丰富，但加工利用能力不足，深加工技术落后，附加值很低，造成资源的巨大浪费，实现羊骨的高值利用具有潜在的市场价值。羊骨营养丰富，胶原蛋白占总蛋白的90%以上，但胶原蛋白结构稳定，难以被吸收利用，并且骨中的钙磷等矿物元素主要以羟基磷灰石形式存在，由骨胶原粘合固定，也不易被有效利用，因此骨粉中的蛋白质和Ca、P的生物利用度很低。酶解是利用畜骨资源的一条有效途径，不仅可制备高附加值的胶原多肽，并且在水解过程中使Ca、P等矿物元素释放。肠道对多肽的吸收能力高于游离氨基酸，利用率高达100%[1～3]，并且羊骨胶原多肽还具有促免疫、抗氧化、美容、抑菌、防治骨质疏松、降血压等生理作用[4～7]；水解过程中形成的离子钙也更容易被人体吸收，部分还可与胶原肽形成生物利用度更高的肽钙螯合物。水解度不同，蛋白肽的主要功能不同，多肽产品的腥苦味也与水解度有关[8]，因此在制备具有某个特定功能的蛋白多肽产品时，水解度的动态监测及控制至关重要。对水解过程建立数学模型，便可通过调控水解参数来控制水解度并对水解过程进行有效监测。本研究以碱性蛋白酶对羊骨粉进行水解，以水解度为指标，建立水解工艺的数学模型，并对水解工艺进行优化，为以后多肽生产提供参数，从而提高羊骨附加值及羊养殖业的综合效益。

1材料与方法

1.1原料与试剂

羊骨粉以新鲜羊骨自制。碱性蛋白酶(Activity≥200 000 U·L-1,太原科谷仪诚商贸有限公司)；OPA试剂现配现用，无水乙醇等其他试剂均为分析纯。

1.2仪器设备

高速万能粉碎机(广州雷迈机械)；802型索式抽提器(天津市玻璃仪器厂)；722G可见分光光度计(上海精密仪器有限公司)；台式高速冷冻离心机(Neofuge23R，上海力申科学仪器有限公司)等。

1.3水解度测定

OPA(邻苯二甲醛)法[9]：一个肽键水解会释放一个游离氨基，游离氨基与OPA反应形成的黄色络合物在340 nm下有最大吸收，在340 nm处测定吸光度，根据文献[9]中的三个公式计算水解度。

1.4单因素试验

骨粉中添加一定比例的水及碱性蛋白酶进行水解，研究骨粉浓度、温度、加酶量、酶解时间、pH对水解度的影响。酶解结束后高温加热终止反应，离心，取上清液测定水解度，结果见表1。

1.5响应面分析

在单因素试验结果的的基础上，利用Box-Behnken实验设计原理，采用4因素3水平响应面分析法，以水解度为响应值(Y)对水解条件进行优化。各响应变量的-1、0、+1水平分别为：底物浓度X1(6%、8%、10%)，温度X2(40 ℃、45 ℃、50 ℃)，时间X3(4 h、5 h、6 h)，加酶量X4(3%、4%、5%)。各因素水平编码表见表2。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

酶催化下的蛋白质水解过程是一个具有动态的平衡的化学过程，制备蛋白肽时，酶解平衡反应的效率受多种因素的影响。各因素在不同水平下，骨粉的水解度均先增加后减少或趋于平稳(图略)，为确定水解度所制作的丝氨酸标准曲线如图1所示。表1列举了每个单因素试验过程中水解度达到峰值时各因素相对应的水平，并以此作为响应面分析的0水平。由表1可以看出，在单因素试验过程中，水解度逐步增加，最终达到24.76%。

图1　丝氨酸标准曲线 Fig.1　The standard curve of serine

表1碱性蛋白酶单因素试验过程中水解度(DH%)达到峰值时对应的各因素水平

Table 1The level of each factor in corresponding to the peak value of DH by alkaline protease

影响因素Affectingfactor底物浓度Substrateconcen-trationpHpHvalue温度Temper-ature加酶量Alcalaseamount酶解时间Hydroly-zingtime水解度峰值/%Peakvalue/%16.618.6322.2823.7924.76水平Level8%945℃4%5h

2.2响应面实验结果

表2羊骨骨粉碱性蛋白酶水解响应面试验设计及结果

Table 2Design and results of response surface methodology when sheep bone powder was hydrolized by alcalase

试验号Testnumber料水比Substrateconcen-tration温度Temper-ature水解时间Hydroly-zingtime加酶量Enzymeamount水解度/%Degreeofhydrolysis/%10-1-1015.442-10-1020.02301-1023.314000026.645-1-10016.7660-10-119.097001123.978100123.6790-11024.63100-10124.5211-101023.1412010124.1813011023.7614100-121.1115110022.211600-1-119.5517000028.111800-1124.501910-1020.0220000028.32211-10019.4522-100-120.2423001-123.3024010-124.9225-100122.1126101025.2427-110022.32

2.3响应面分析

通过上述回归方程所作的响应值水解度对各因素的三维曲面图如图2所示。由图2可以看出，骨粉浓度(料水比)、温度、时间、pH、加酶量等并非越高(长)越好，实际生产过程中，应以节约生产成本，降低能耗和时耗为原则，在优化的工艺条件下进行生产。A～F图的等高线形状也可以看出水解温度(X2)与水解时间(X3)之间，水解温度(X2)和加酶量(X4)之间交互作用显著，其他各因素间的交互作用不显著。

表3　回归方程的方差分析结果

注：**表示差异极显著，P<0.01；*表示差异显著，P<0.05。

Note:** means significant difference at 0.01 level(P<0.01) while * means significant at 0.05 level.

2.4模型验证实验

运用Minitab软件的响应优化器得到的模型最优解，水解度最大预测值为28.39%。验证实验考虑到实际操作的便利，将碱性蛋白酶水解工艺如下修正：料水比由最优解9.32%调整到9%(W/V)、水解温度由45.25 ℃调整到45 ℃、水解时间和加酶量不变，分别为325 min和4.25%(E/S)，在pH9条件下酶解，水解度的平均值为28.12%，进一步说明该模型可靠。

图2　羊骨粉碱性蛋白酶水解双因子交互效应分析 Fig.2　Analysis of 2-factor interaction effect during alcalase hydrolysis of sheep bone powder

3讨论

3.1水解度测定方法的选择

水解度表示蛋白质的水解程度，是确定酶解终点的依据之一[10]。每种水解度测定方法均有各自的优缺点和适用范围。甲醛滴定法虽简单快速，但测定结果往往偏低[8,11]，这是由于脯氨酸(Pro)与甲醛作用生成不稳定的化合物[11]。而脯氨酸恰恰是骨胶原和骨胶原肽的特征性氨基酸，含量较高，所以本研究不适合使用甲醛滴定法。茚三酮比色法由于以单一氨基酸做标准也容易造成误差[8]。双缩脲比色法操作简单快速，测定微弱酶水解物的水解度时误差较小[11]，因此也不适合本研究。pH-Stat法利用时需用其它方法加以校正，结果精确度受蛋白酶种类影响很大；三硝基苯磺酸法(TNBS)灵敏度高且不受酶种类影响，但反应时间长，操作麻烦，不适合对水解度进行实时监测[12]。2001年P.M.Nielsen对TNBS法进行改进，建立的邻苯二甲醛法(OPA)比TNBS法更快速更精确，更简单、更快速，该法也不受水解度高低的局限[9]。因此本研究选用OPA法对水解度进行测定，过程仅需2 min。

3.2羊骨胶原水解度

本研究单因素试验过程中，水解度随着各因素的优化而逐步提高，最终达到24.76%，经过响应面优化，所建数学模型的最大预测值为28.39%，经验证平均值为28.12%，比优化前提高了3.36%。詹萍等利用二次旋转正交组合设计对碱性蛋白酶和风味蛋白酶的双酶酶解工艺进行了优化，水解度达到了33.19%[13]，高于本研究结果，这是由于测定DH的方法不同所导致的，但确定的最优条件与本研究所确定的工艺条件比较接近。其他以水解度为指标研究羊骨酶解工艺的报道很少，其他研究多以制备多肽的活性为指标进行确定。但蛋白水解物的活性往往是短肽在作用，水解度越高，短肽生产率越高，所制备的多肽可能功能更加全面。有关其他来源蛋白质的水解工艺确定中，研究者多以水解度为指标进行筛选。

3.3所建模型与工艺

本研究所建立的数学模型与实验数据拟合度高，经过验证能比较准确的预测不同酶解条件下的水解度，在以碱性蛋白酶水解制备胶原多肽的过程中可方便地通过对底物浓度、加酶量、酶解温度和时间对水解度进行实时监测和控制，方便生产。通过优化后的工艺制备的羊骨胶原肽可用作高档水产饲料的添加剂[14]，或制成多肽营养饮料[15]。本研究以骨粉为原料而非对提取的胶原蛋白进行水解，因而减少了污染的机会，简化了工艺，且尽可能多地保留了骨中的Ca、P等矿物元素。对通过本工艺制备的胶原多肽进行抗氧化性、免疫调节、降血压、降血脂等功能分析，其应用性将进一步拓展，为羊骨的综合利用和高值开发开拓了一条新的途径，将产生一定的经济利益和社会效益。

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(编辑：马荣博)