香水梨采后果实中可溶性糖及其代谢酶变化的研究

张欣　贝盏临　张安东

摘要：以宁夏海原香水梨（Pgrus ussuriensismaxim）为试材，研究采后在（20±0.5） ℃下果实中可溶性糖代谢及相关酶活性的变化特征。结果表明，随着贮藏时间的延长，香水梨果实中果糖含量前、中期不断上升后期略微下降；葡萄糖含量先升后降；蔗糖含量逐渐降低，与之对应的蔗糖合成酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性均不断降低，且SS活性均低于SPS。

关键词：香水梨（Pgrus ussuriensismaxim）；可溶性糖；蔗糖合成酶；蔗糖磷酸合成酶

中图分类号：S661.2；TS255.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）24-6351-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.066

Abstract：The changes of soluble sugar metabolism and related enzyme activity in the fruit of Ningxia haiyuan Pgrus ussuriensismaxim after （20±0.5）℃ were studied. The results showed that with the storage time extension， fructose content rised in earlier and mid-term stage while declined slightly in later stage； glucose content first increased and then decreased； sucrose content decreased gradually， and the corresponding sucrose synthase （SS） and sucrose phosphatase （SPS） activity were gradually decreased and the activity of sucrose synthase were lower than that of sucrose phosphate synthase.

Key words：Pgrus ussuriensismaxim；soluble sugar；sucrose synthase；sucrose phosphate synthase

香水梨（Pgrus ussuriensismaxim）属于波斯梨科果实，具有润肺清肺的功能，故深受大家的喜爱，而分布于甘肃、宁夏等地的香水梨可谓栽培历史悠久[1]。香水梨具有极耐寒、抗旱性、耐涝性、抗盐碱性，产果率高，容易丰收、稳产，能够适应和抵抗各种自然灾害，是具有地方特色的优质经济梨树；其果实甜美，糖、维生素C、铁、锌等含量较高[2]，果实成熟时可立即食用，也可贮藏到冬季后食用，而且贮藏后的梨果色金黄，风味更佳。这一贮藏过程被称为“出汗”，指的就是香水梨在秋冬贮藏季节内受冻，然后又解冻，不断反复多次以后，使果实内成分发生变化，而香水梨的口味由采摘时的酸涩转变为甜美可口，这是发生了复杂的生理转变过程。果实中糖含量的多少是影响果实口味的主要指标之一，糖含量直接决定了果实品质的优劣，所以如何提高果实中糖类含量已经成为了提升梨果品质的主要研究课题，然而对于如何提高果实中糖含量，首先要深入探讨果实中糖代谢和累积变化规律，便于在果实发育过程中采用相应的对策来控制糖的定向积累[3]。目前对于香水梨中糖代谢的研究主要局限在果实发育过程中[4]，而针对果实采后贮藏期内糖代谢系统的研究却鲜有报道。本研究以香水梨为试验材料对果实采后贮藏期内糖代谢系统进行初步研究，试图发现果实贮藏期内糖代谢系统变化规律，旨在对贮藏过程的香水梨中可溶性糖代谢系统进行初步探索。本试验着重对香水梨在贮藏过程中果实内糖代谢进行有关研究：香水梨蔗糖、葡萄糖和果糖含量的动态变化；香水梨蔗糖合成酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）的动态变化，为今后有关糖代谢的相关性研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

香水梨于2014年10月采自宁夏海原县果园中，选取具有良好品种特性、果实外表无明显损伤、无病虫害、大小均一的果实，将果实保存于（20±0.5） ℃备用，并分批抽样进行试验。

1.2 试剂

尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG），6-磷酸-果糖（F6P），80%乙醇，NaOH，MgCl2，硫酸铵，蒽酮（AR），活性炭（AR），浓硫酸（AR），浓盐酸（AR），果糖（AR），蔗糖（AR），葡萄糖（AR），间苯二酚，Tris，乙二醇，巯基乙醇，EDTA等生化试剂。

缓冲液A的配置：100 mmol/L Tris（pH 7.0），10 mmol/L MgCl2，2%乙二醇，20 mmol/L巯基乙醇，2 mmol/L EDTA。

缓冲液B的配置：20 mmol/L Tris（pH 7.0）， 10 mmol/L MgCl2，10%乙二醇，5 mmol/L巯基乙醇，2 mmol/L EDTA。

1.3 仪器

UV1000型紫外分光光度计（上海天美公司），JA5003B型电子天平和FA2104B型分析天平（上海精密科学仪器有限公司），HH-4型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），ALPHA-1-2型真空冷冻干燥机（北京博劢行仪器有限公司），100 μL移液枪（上海佳安分析仪器有限公司），FR-1210型精密烘箱（天津市泰斯特仪器有限公司），TG16G型离心机和旋转蒸发仪（上海比朗仪器有限公司），冷冻离心机（Sigma公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 葡萄糖、蔗糖和果糖的提取及含量的测定 样品中葡萄糖、蔗糖和果糖含量的测定采用蒽酮比色法[5]。可溶性糖的提取方法参考李合生[6]的方法略加改动。标准曲线的制作：取6个25 mL的试管，编号，按表1配制不同溶度的可溶性糖（葡萄糖/果糖/蔗糖）标准液，精确吸取可溶性糖（葡萄糖/果糖/蔗糖）溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL于已标记号的1、2、3、4、5、6号的试管中，依次加入1.00、0.90、0.80、0.70、0.60、0.50 mL 80%乙醇；在每只试管中加入4.0 mL蒽酮试剂，将各管摇匀，在沸水浴中保持10 min；取出后冷却至室温，于625 nm波长处，用1号管调零，测定不同浓度的标准液对应的吸光度。每组3次重复，以OD值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。样品中可溶性糖的测定：精确吸取上述1.0 mL还原性糖提取液，同样加入4.0 mL蒽酮试剂充分混合，其余步骤同上。记录各组数据，每组3次重复，用1号管调零于625 nm处测定吸光度，取平均值并计算出每克样品中还原糖的含量。

1.4.2 蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性的测定 样品的SS与SPS活性采用紫外分光光度法完成测定。

酶提取液的制备：酶液的制备与酶活力测定参文献[7，8]的方法但略有改动。

标准曲线的绘制：分别取0.60 mL不同质量浓度（20～100 μg/mL）蔗糖溶液加入0.15 mL酶液充分混合均匀。在30 ℃水浴中保持10 min，取出后加入0.20 mL 2 mol/L NaOH，沸水中煮10 min，冷却至室温，依次加入2.8 mL 30% 盐酸及0.8 mL 0.1%间苯二酚，摇匀，80 ℃水浴保温10 min，取出冷却至室温，将酶液在480 nm处测定吸光度，绘制蔗糖标准曲线。

SS活性的测定：在0.60 mL反应体系中（含0.15 mL 200 mmol/L Tris-HCl，pH 7.0，0.15 mL 40 mmol/L MgCl2，0.15 mL 40 mmol/L果糖，0.15 mL 12 mmol/L UDPG），其余步骤与标准曲线绘制方法相同[9]。

SPS活性的测定：在SS反应体系中用40 mmol/L F-6-P取代40 mmol/L果糖，其余步骤与SS的测定方法相同。对于试验数据采用Origin 8.0进行分析、计算标准差并制作相关图表。

2 结果与分析

2.1 贮藏期间香水梨可溶性糖含量动态变化

2.1.1 可溶性糖标准曲线的制定 由图1可知，蔗糖、葡萄糖、果糖3种可溶性糖标准曲线符合测定要求，可用于对香水梨可溶性糖含量的测定。

2.1.2 贮藏期间香水梨果实中可溶性糖含量变化 由图2可知，在整个采后贮藏期内，香水梨果实中蔗糖含量不断降低，整个下降趋势都很明显，并且一直低于葡萄糖、果糖的含量。由图3可知，在采后20 d的贮藏期内葡萄糖含量先上升后缓慢下降。在贮藏前中期，香水梨果实中葡萄糖含量不断增加，到贮藏期14 d时达到最大值，随着贮藏时间的推移，当果实进入贮藏后期，葡萄糖含量开始下降。由图4可知，在整个采后贮藏期内香水梨果糖含量比较高，并且在随后的贮藏前中期不断上升，进入后期后果糖含量开始略微下降。在贮藏期开始的时候，葡萄糖含量远低于同时期的果糖含量，大约为果糖的54%左右。另外在贮藏过程中香水梨果糖含量比较高，总体含量均高于葡萄糖和蔗糖之和。相对于葡萄糖和果糖，蔗糖在果实贮藏期间最低。贮藏期间内各个时期果实中可溶性糖含量以果糖为主，其次为葡萄糖，蔗糖含量则最少。

2.2 贮藏期间香水梨SS、SPS活性动态变化

2.2.1 贮藏期间内SS含量变化 由图5可知，蔗糖标准曲线的线性回归方程为y=0.004 3x-0.007 7，R2=0.997 1，符合测定要求，可用于对香水梨SS活性的测定。图6为香水梨果实中SS活性随贮藏期间的变化。在香水梨贮藏期间内，果实中SS在贮藏初期酶活性最高，随着贮藏时间的推移不断降低，在贮藏后期SS活性的下降趋势又明显变缓。

2.2.2 贮藏期间香水梨SPS活性动态变化 由图7可知，蔗糖标准曲线的线性回归方程为y=0.004 2x-0.008 4，R2=0.996 8，符合测定要求，可用于对香水梨SPS活性的测定。在香水梨贮藏期间内，果实中SPS在贮藏初期酶活性都最高，随着贮藏时间的推移不断降低，在贮藏后期SPS活性的下降趋势又明显变缓。在整个贮藏期间SS均低于SPS。

2.3 相关性分析

由表2可知，蔗糖与葡萄糖呈极显著负相关，蔗糖含量不断减少，而葡萄糖含量不断增加，蔗糖消耗的一部分有可能会转变为葡萄糖，且极有可能在贮藏期内蔗糖主要转变为葡萄糖。贮藏期间内香水梨果实中蔗糖含量和SPS活性呈线性正相关，与SS活性也呈线性正相关，说明贮藏期内果实中蔗糖含量的逐渐下降和2种酶活性下降趋势有着密切的关系，这与前人的研究相似[10]。

3 讨论

糖类是生物体内的组分，它们本身就是细胞和生物体能量的主要来源，也是生物体许多重要性质和功能不可缺少的基本元素[11]。糖类在植物体内不仅仅是光合作用的产物，又是呼吸作用的底物[12]，绝大部分光合产物主要以蔗糖等形式通过韧皮部运输到果实中，在果实发育的过程中经过一系列酶代谢和跨膜运输，最后以部分蔗糖或者以果糖、葡萄糖、淀粉或其他糖类形式累积在果实中，从而产生了不同口味的果实。在本试验果实采后贮藏过程中，香水梨果实中葡萄糖含量先上升后下降，蔗糖含量不断减少。这可能是由于果实在贮藏过程初期，果实体内参与分解蔗糖的酶活性比较高，连续分解蔗糖转化为葡萄糖，从而使葡萄糖含量上升，蔗糖含量下降；而在贮藏中后期，一是因为香水梨在贮藏期间呼吸作用不停的消耗，再加上参与蔗糖代谢的相关酶活性由于贮藏温度的原因开始下降，导致了在贮藏中后期香水梨中葡萄糖和蔗糖含量都开始下降。

在植物糖代谢过程中，SS通过催化蔗糖的分解与合成，保持蔗糖的浓度梯度，来控制果实中糖累积[13-15]。而SPS活性的高低决定了蔗糖在果实中含量的多少[16]。在果实贮藏过程中，香水梨果实内蔗糖含量与相关蔗糖代谢酶活性在采后贮藏期内变化一致，均呈线性正相关。这与Macrae等[17]对桃果实的研究发现一致，即随着果实进入成熟软化期，果实内淀粉水解，SPS活性上升，蔗糖含量开始不断增加，蔗糖积累和SPS活性的增加为线性正相关；Moriguchi等[18]对日本梨的研究也表明，SS、SPS 2种酶活性均在贮藏过程中表现出逐渐下降的趋势。

果实糖代谢是一个非常复杂漫长的历程，果实成熟过程中糖类的累积并非是由简单的一种酶在起作用，而是多种糖代谢相关酶的相互调节的结果。目前，对果实糖组分组成、细胞内代谢相关酶的分布、果实成熟过程中糖含量和相关酶活性的动态变化等已有一定的认识[15]。研究香水梨贮藏过程中可溶性糖及其相关酶活性的变化，可以为进一步研究梨果实SS、SPS等糖代谢酶基因的表达调控机理提供参考。对今后果实中生态因子、内源激素、糖信号的研究具有重要意义。

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