莲子红皮多糖抗氧化与抑菌活性研究

薛淑静　杨德　李露　何建军　关健　曾予　王肖莉

摘要：以莲子（Semen nelumbinis）红皮磨皮粉为原料提取多糖，研究其抗氧化性及抑菌活性。研究发现莲子红皮多糖对羟自由基（·OH）的清除率达96.29%，对DPPH自由基（DPPH·）的清除率为41.79%，莲子红皮多糖的体外抗氧化活性低于维生素C；抑菌试验表明，莲子红皮多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用，最小抑菌浓度为20 mg/mL，在酸性条件下的抑菌作用更明显，且对大肠杆菌生长的抑制作用比金黄色葡萄球菌强，对黄曲霉和黑曲霉没有抑菌作用。

关键词：莲子（Semen nelumbinis）；红皮多糖；抗氧化性；抑菌性

中图分类号：S682.32；R285.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）24-6342-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.064

Abstract：The antioxidant and antimicrobial activities of the polysaccharides from red skin of locus seed were assessed in this paper. The study found that the polysaccharide on hydroxyl free radical （·OH） removal effect reached 96.29%， the highest DPPH· free radical （DPPH·） scavenging effect reached 41.79%. Through comparing with VC， the polysaccharide on free radical clearance rate was lower. The polysaccharide from red skin of locus seed had a strong antibacterial effect on the bacteria with the minimum inhibitory concentration of 20 mg/mL. Meanwhile，the antibacterial effect was stronger under acidic condition. The effect on colibacillus was more obvious than Staphylococcus aureus. And the fungus had no antibacterial effect on Aspergillus favus and Aspergillus niger.

Key words：Semen nelumbinis；polysaccharide from red skin of locus seed；antioxidant activity；antimicrobial activity

莲子（Semen nelumbinis）是睡莲科植物莲的果实和种子。莲子是补脾止泻、益肾涩精、养心安神的常用中药，也是民间常用的滋补品。莲子含有丰富的多糖、磷脂、生物碱和类黄酮等营养保健成分，列入中国卫生部公布的首批既是食品又是药品的品种名单[1]。

莲子的加工一般要经过干燥、分级、去壳、除皮去心等工序，去皮一般采用手工除皮和机械磨皮两种方式。这两种去皮工艺生产率较低，损耗高。例如采用机械磨皮法，每加工100 kg红莲，就会磨去约15 kg红皮粉，目前这层红皮粉尚无有效的利用方式，由于味涩甚至不能作为牲畜饲料，只能大量堆于田间地头[2]。这些加工副产物莲皮粉含有多糖、黄酮、生物碱等多种生物活性成分，若能有效地开发利用，将变废为宝。

陈轩等[1]对莲子皮的化学成分进行了初步分析，徐虹等[2，3]报道了从莲皮粉中提取多糖和蛋白质的工艺研究，多糖和蛋白质得率分别为8.42%、30.75%；王超等[4]用草酸铵溶液作为提取溶剂提取了红湘莲莲皮粉中的果胶多糖。而关于莲子红皮多糖抗氧化活性和抑菌作用研究未见文献报道。本研究以莲子磨皮粉为原料，提取其水溶性多糖，考察了莲子红皮多糖对羟自由基（·OH）、DPPH自由基（DPPH·）的清除率，以及莲子红皮多糖对黑曲霉（Aspergillus nige）、黄曲霉（Penicillium Chrysogenum）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylosocus aureus）的抑菌活性，以期为莲子磨皮粉的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料 莲子红皮磨皮粉由湖北省洪湖市晨光实业有限公司提供。

1.1.2 供试菌种 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌；真菌：黄曲霉、黑曲霉均由华中农业大学楚天学院微生物实验室提供。

1.1.3 试剂 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、酵母浸膏、牛肉浸膏均为生化试剂；苯酚、浓硫酸、硫酸亚铁、水杨酸、30%过氧化氢、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、抗坏血酸、氢氧化钠、乙醇等均为分析纯试剂。

1.2 主要仪器设备

立式压力蒸汽灭菌器（LDZM-80KCS，上海申安医疗器械厂）、恒温恒湿箱（HPX160BSH-TV，上海新苗医疗器械制造有限公司）、集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S，上海东玺制冷仪器设备有限公司）、台式高速冷冻离心机（TGL-16，长沙平凡仪器仪表有限公司），紫外可见分光光度计（752，上海光谱仪器有限公司）

1.3 试验方法

1.3.1 培养基的配制

1）牛肉膏蛋白胨培养基。牛肉膏2.5 g、蛋白胨5 g、氯化钠2.5 g、琼脂10 g、水500 mL，pH 7.0。

2）马铃薯-葡萄糖蛋白胨培养基（PDA）。马铃薯300 g、葡萄糖10 g、琼脂20 g、水1 000 mL。取马铃薯切块，加水1 000 mL，加热煮沸25～30 min后补足失水至所需体积，加入葡萄糖、琼脂，继续加热溶化并补足失水。

3）葡萄糖蛋白胨培养基。葡萄糖5 g、蛋白胨6 g、酵母浸膏6 g、牛肉浸膏1.5 g、吐温80 0.1%、琼脂20 g、水1000 mL，pH 7.4。

1.3.2 莲子红皮多糖的提取与含量测定 以莲子红皮磨皮粉为原料，参照文献[2]水提醇沉法提取莲子红皮多糖。采用苯酚-硫酸比色法测定莲子红皮多糖含量[5]。

1.3.3 莲子红皮多糖对羟自由基（·OH）的清除作用 称取干燥的莲子红皮多糖样品1.0 g用蒸馏水溶解，定容至100 mL，制得10.0 mg/mL样品多糖液。采用Fenton试剂制备羟自由基。取0、2.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0 mL样品多糖液，再依次加入9 mmol/L FeSO4 1 mL、9 mmol/L 水杨酸-乙醇1 mL、8.8 mmol/L H2O2 1 mL[6]。以蒸馏水代替H2O2测本底吸光度AR。将空白对照、本底组、样品组在37 ℃水浴反应30 min后，在510 nm处测量3组反应液的吸光度，按照公式（1）计算清除率E。同时用0.5 mg/mL浓度的维生素C（VC）水溶液作样品对照试验。

E=1-■×100% （1）

式中，E为羟自由基（·OH）的清除率（%）；AS为加入样品的吸光度；AR为本底吸光度；A0为空白对照的吸光度。

1.3.4 莲子红皮多糖对DPPH自由基（DPPH·）的清除作用 取6.5×10-3 mmol/L DPPH-60%乙醇溶液4.5 mL，分别加入不同浓度多糖提取液0.5 mL，混匀，反应30 min，于517 nm测定吸光度AS。同时，测定样品溶液0.5 mL与60%乙醇4.5 mL混合液在517 nm处的吸光度AR，再测定4.5 mL DPPH-60%乙醇溶液与0.5 mL 60%乙醇在517 nm处的吸光度A0[7]。按照公式（2）计算清除率E。同时用0.01 mg/mL浓度的VC水溶液作样品对照试验。

E=1-■×100% （2）

1.3.5 莲子红皮多糖的抑菌效果 将熔化好的培养基倒入平皿内约25 mL（培养皿底约一半高度），待其凝固，用移液枪吸取0.5 mL供试菌悬液加到上述平板中，用无菌玻璃刮铲涂布均匀。在平板底部标记药液浓度后，用无菌镊子将牛津杯按标记位置放置在培养基上，用移液枪在相对应的牛津杯中加入不同浓度的药液（用无菌水配制的浓度为10、20、30、40、50 mg/mL的莲子红皮多糖溶液）0.2 mL，以生理盐水为空白对照，在最适温度下培养一段时间（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌置37 ℃的恒温培养箱中培16～18 h，黑曲霉、黄曲霉在28 ℃的恒温培养箱中培养2～3 d）。取出测量并记录抑菌圈直径，比较不同浓度莲子红皮多糖的抑菌效果[8]。

1.3.6 pH对莲子红皮多糖抑菌活性的影响 选择抑菌效果最好的莲子红皮多糖液10 mL，根据大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长pH范围在4～8之间，黑曲霉、黄曲霉的最适生长pH范围在6～8之间，用1 mol/L 盐酸和0.1 mol/L NaOH 配制成pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的多糖溶液[9]。在平板底部标记药液pH后，用无菌镊子将牛津杯按标记位置放置在培养基上，用移液枪在相对应的牛津杯中加入不同pH的药液0.2 mL，以生理盐水为空白对照，放入恒温培养箱内培养一段时间（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌置37 ℃培养16～18 h，黑曲霉、黄曲霉在28 ℃的中培养2～3 d）。取出测量并记录抑菌圈直径，比较不同pH对莲子红皮多糖的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 莲子红皮多糖的抗氧化性

2.1.1 莲子红皮多糖对·OH的清除作用 不同浓度莲子红皮多糖对·OH的吸光度A，按照公式（1）计算清除率E，试验结果见图1。结果表明，莲子红皮多糖对·OH有一定的清除作用。随着多糖浓度的不断增加，对·OH的清除作用呈现增强的趋势，多糖浓度6.0 mg/mL时，趋势渐缓；多糖浓度10.0 mg/mL时清除率最高，达到96.29%。

2.1.2 VC对·OH的清除作用 不同浓度VC对·OH的试验结果见图2。VC对·OH有很强的清除作用，随着VC浓度的不断增加，对·OH的清除作用呈现不断增强的趋势，在浓度为0.4 mg/mL时清除率达到100%。相同浓度的莲子红皮多糖对羟自由基清除作用较VC弱。

2.1.3 莲子红皮多糖对DPPH·的清除作用 不同浓度莲子红皮多糖对DPPH·的吸光度A按照公式（2）计算清除率E，试验结果见图3。结果表明，莲子红皮多糖对DPPH·有清除作用，多糖浓度在0～120 μg/mL时清除作用随浓度的增大呈增长趋势，在120 μg/mL时最大，达到41.79%，之后清除率呈下降趋势。

2.1.4 VC对DPPH自由基（DPPH·）的清除作用 不同浓度VC对DPPH·的试验结果见图4。由图4可知，随着VC浓度的不断增大，对DPPH·的清除作用呈现增强趋势，在10 μg/mL时清除率达到了57.63%。相同浓度的莲子红皮多糖对DPPH自由基清除作用低于VC。

2.2 莲子红皮多糖的抑菌作用

2.2.1 莲子红皮多糖对黄曲霉和黑曲霉的抑菌作用 黄曲霉和黑曲霉通过28 ℃培养48 h后，观察未出现抑菌圈，结果见图5（图中空白、20、100 mg/mL分别编号为0、1、2）。因此，莲子红皮多糖液对黄曲霉和黑曲霉没有抑菌作用。

2.2.2 莲子红皮多糖对大肠杆菌的抑菌作用 通过37 ℃恒温恒湿生化培养箱培养大肠杆菌24 h后，观察多糖对大肠杆菌的抑制作用并测量抑菌圈的直径，结果见图6（图中空白、20、40、60、80、100 mg/mL分别编号为0、1、2、3、4、5）。由图6可知，空白组未出现抑菌圈，莲子红皮多糖浓度20 mg/mL时，抑菌圈出现。因此，莲子红皮多糖对大肠杆菌有抑制作用，最小抑菌浓度为20 mg/mL，且随多糖浓度增加，抑菌圈增大，试样中多糖浓度100 mg/mL的试样抑菌性最强。

2.2.3 莲子红皮多糖对金黄色葡萄球菌的抑菌作用 通过37 ℃恒温恒湿生化培养箱培养大肠杆菌和金黄色葡萄球菌24 h后，观察多糖对金黄色葡萄球菌的抑制作用并测量抑菌圈的直径，结果见图7（图中浓度空白、20、40、60、80、100 mg/mL分别编号为0、1、2、3、4、5）。空白组未出现抑菌圈，莲子红皮多糖浓度20 mg/mL时出现抑菌效果。因此，莲子红皮多糖对金黄色葡萄球菌有抑制作用，最小抑菌浓度为20 mg/mL，且随多糖浓度增加，抑菌圈增大，试样中多糖浓度100 mg/mL的试样抑菌性最强。

2.3 pH对莲子红皮多糖抑菌作用的

根据不同浓度莲子红皮多糖的抑菌研究可知多糖对真菌无抑菌性，浓度范围内对细菌最强抑制性浓度为100 mg/mL。已知适合大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的pH为4～8（最适pH为6～8），在该范围将100 mg/mL糖液制成不同pH进行试验。通过37 ℃恒温恒湿生化培养箱培养24 h后观察不同pH莲子红皮多糖液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用。

2.3.1 对大肠杆菌抑菌作用 经过37 ℃恒温恒湿生化培养箱培养24 h后，观察不同pH莲子红皮多糖溶液对大肠杆菌的抑制作用，试验结果见图8（图中pH 4、5、6、7、8编号分别为4、5、6、7、8）。在大肠杆菌适合生长pH 4～8范围内，100 mg/mL莲子红皮多糖在pH 4时对大肠杆菌有较强的抑制作用，随着pH的升高，抑菌圈直径呈现减小的趋势。

2.3.2 对金黄色葡萄球菌作用 经过37 ℃恒温恒湿生化培养箱培养24 h后，观察不同pH的莲子红皮多糖溶液对金黄色葡萄球菌的抑制作用，试验结果见图9（图中pH 4、5、6、7、8分别编号为4、5、6、7、8）。在金黄色葡萄球菌适合生长pH 4～8范围内，100 mg/mL莲子红皮多糖溶液在pH 4时对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最显著，随着pH的升高，抑菌圈直径呈现减小的趋势。不同pH莲子红皮多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制作用比较见表1。由表1可知，在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌适合生长pH 4～8范围内，随着pH增大，抑菌圈的直径变小，说明莲子红皮多糖在偏酸性条件下的抑菌作用较强。在pH>4时，100 mg/mL莲子红皮多糖溶液对大肠杆菌的抑制作用较强，在pH 4时，100 mg/mL莲子红皮多糖溶液对金黄色葡萄球菌的抑制较强。

3 小结

莲子红皮多糖对·OH和DPPH·有明显的清除作用。莲子红皮多糖对·OH清除率可达96.29%，且随多糖浓度增加清除率增大；在0～120 μg/mL时，对DPPH·的清除作用随浓度增加而增强，浓度大于120 μg/mL时，清除率下降，120 μg/mL时清除率最高，达41.79%。通过比较，莲子红皮多糖的体外抗氧化活性略低于VC。

莲子红皮多糖对黄曲霉和黑曲霉没有明显的抑菌作用；对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用，最小抑菌浓度为20 mg/mL，随多糖浓度增加，抑菌圈变大，在试验浓度范围内，最大浓度100 mg/mL时抑菌圈最大；莲子红皮多糖在酸性条件下的抑菌作用较好；且在酸性条件下对大肠杆菌生长的抑制作用比金黄色葡萄球菌强。

参考文献：

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