砂梨核心种质SSR标准指纹图谱构建

张靖国　田瑞　陈启亮　杨晓平　范净　胡红菊

摘要：砂梨[Pyrus pyrifolia （Burm. f.）Nakai]一般为二倍体植物，染色体基数为17，从分布在砂梨17条不同的染色体上的60对简单序列重复标记（Simple sequence repeats，SSR）引物中筛选出分别位于17条染色体的17对多态性引物对97份砂梨核心种质进行扩增，共检测到等位基因276个，每对引物检测到的等位基因数在8～26个，平均为16.4个，表明所选引物具有较高的鉴别力。多态信息含量指数（PIC）变幅为0.670（CH03d12）～0.926（CH03d02），平均为0.817，显示出较高的多态性信息，表明砂梨核心种质蕴含有极为丰富的遗传多样性，具有极高的代表性。试验建立起一套基于SSR分子标记的引物组合与鉴定体系标准，通过反映不同染色体上的遗传信息，在同一平台上可以同时将数百份甚至上千份的品种资源区分开来，这对梨科研、教学及生产中的资源收集保存、品种鉴别、品种权保护具有十分重要的意义。

关键词：砂梨[Pyrus pyrifolia （Burm. f.）Nakai]；核心种质；简单序列重复标记；指纹图谱

中图分类号：S661.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）24-6284-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.048

Abstract： 17 primer pairs with clear polymorphic bands were selected from 60 pairs of Simple sequence repeats （SSR） locus that covering 17 linkage groups of Pyrus pyrifolia （Burm. f.） Nakai genetic map， and were then amplified in 97 varieties of P. pyrifolia core collection. A total of 276 polymorphic bands were obtained with 8 to 26 bands per primer locus （averaging 16.4 bands）. The polymerphism information content （PIC） of the 17 SSR loci ranged from 0.670 to 0.926 with an average of 0.817， which show abundant genetic polymorphism in P. pyrifolia core collections. Results from these standard sets of SSRs are presented and can be used to facilitate comparison of data sets from different germplasm collections to detect duplicates and synonyms.

Key words：Pyrus pyrifolia （Burm. f.）Nakai； core collections； simple sequence repeats； fingerprint

关于种质资源的指纹图谱或分子身份证构建是当前资源鉴定评价研究的热点之一。国际植物品种权保护联盟（UPOV）已将DNA分子标记鉴定纳入农作物品种DUS（Distinctness，uniformity，stability）测试内容，并在BMT测试指南草案中将构建 DNA 指纹数据库的标记方法确定为简单序列重复标记（Simple sequence repeats，SSR）和单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）。而SSR标记因具有多态性高、重复性好、共显性遗传和易于检测等优点，已被 UPOV 生物化学和分子技术工作组验证为植物新品种保护最广泛应用的标记体系[1]。SSR分子标记已经被广泛用于包括果树在内的各种作物指纹图谱构建研究。然而，一个普遍存在的问题是由于不同的资源保存单位所保存的相同种质资源常常由于彼此研究所使用的鉴定体系或引物组合不同而难以相互比较，这使得其资源圃中存在的同物异名、同名异物等问题的种质难以得到准确鉴定和发现，这给种质资源的利用带来一定风险。因此，建立一套标准的SSR引物组合和鉴定方法将会有助于解决这一难题。

国家果树种质武昌砂梨圃多年来一直致力于砂梨[Pyrus pyrifolia（Burm. f.）Nakai]种质资源的收集保存、鉴定评价、提供利用等工作。目前共收集保存砂梨资源800余份，并已经开展核心种质构建工作[2]。试验拟建立一套基于SSR分子标记的引物组合和鉴定体系标准，并将砂梨核心种质的参考指纹图谱作为种质资源保护的依据，同时也为不同研究单位的砂梨种质鉴定等研究提供方便。

1 材料与方法

1.1 植物材料

试材为砂梨核心种质97份，均采自国家果树种质武昌砂梨圃。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用改良CTAB法提取梨叶片基因组DNA。所提DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用分光光度法定量后，-20 ℃保存备用。

1.2.2 SSR引物筛选 为了使构建的分子身份证能够尽量全面的反映梨全基因组所有染色体遗传信息，参照Terakami等[3]和Celton等[4]构建的梨遗传连锁图，选择分布于梨17个连锁群的60对多态性SSR引物用于筛选，引物序列参照Yamamoto等[5]、Liebhard等[6]的报道。正向引物5′端加了一个FAM的荧光标记。所有引物由北京鼎国生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增及产物检测 PCR反应体系包括10×PCR buffer（含Mg2+）5 μL，Taq酶（2U/μL）1 μL，dNTPs （10 mmol/L） 1 μL，上下游引物（10 mmol/L）各1 μL，DNA模板（50 ng/μL）1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反应在Gene Amp PCR System 9 600（Perkin Elmer，USA）上进行。PCR反应程序为94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，48～56 ℃、30 s，72 ℃、1 min，共35个循环；72 ℃、10 min。

扩增产物经过ABI3730X Genetic Analyzer （Applied Biosystems，USA）分离，采用ROX500作为分子量分析内标，通过GeneMapper v 4.0 软件分析得到不同样品扩增片段的长度。

1.2.4 数据统计分析 SSR位点的多态性信息含量指数（Polymorphism information content，PIC）的计算公式为PIC=1-ΣPi2，式中Pi表示第i个等位位点出现的频率。

2 结果与分析

2.1 SSR引物筛选

通过对60对SSR引物进行扩增检测，最终确定多态性高、扩增产物清晰且分别位于17条染色体上的17对SSR引物用于指纹图谱构建，这17对SSR引物的基本信息见表1。

2.2 引物等位基因信息分析

分析表1可知，17对引物在97份试材中共检测到等位基因276个，每对引物检测到的等位基因数在8（CH03d12）～26（CH04e05和CH03d02）个，平均为16.4个。引物位点的PIC变幅为0.670（CH03d12）～0.926（CH03d02），平均为0.817，显示出较高的多态性信息，表明砂梨核心种质蕴含有极为丰富的遗传多样性，同时也表明所筛选的17个SSR位点具有较高的鉴别力。

2.3 砂梨核心种质指纹图谱构建

利用筛选出的17对SSR引物对97份砂梨核心种质进行扩增，获得了不同材料在不同位点的等位基因片段大小，具体见表2和图1。例如木瓜梨在位于LG1的NH013a位点的扩增片段大小为200 bp和204 bp，香蕉梨在NH013a、CH03d12、CH01h10、NH017a、NH004a 5个位点经过反复多次验证均没有扩增产物，表明该品种可能在这5个位点发生重组或出现了变异。

3 讨论

SSR引物是遗传连锁图构建的理想标记，而目前多数主要作物的遗传连锁图谱已经完成。因此在进行指纹图谱研究时，可以考虑利用遗传连锁图谱中揭示的遗传信息。如陈昌文等[7]参照桃遗传连锁图上的SSR位点信息，每条染色体选择2个SSR位点，共筛选出16个SSR位点用于中国桃主要品种资源及其野生近缘种的分子身份证构建。梨目前已经有较为饱和的遗传连锁图[3，4]，大量的SSR位点已经定位于对应于染色体的遗传连锁群上。因此试验从已经定位梨遗传连锁图谱上的SSR位点可以进行筛选，最终确定分布于17个连锁群的17个SSR位点可以进行指纹图谱构建，以期能够反映不同染色体上的遗传信息。此外，试验选定的17对SSR引物中的8对引物（以CH开头）由苹果中开发得到[6]，其在梨分子身份证构建中的成功应用，表明苹果与梨基因组具有较高的相似性。

SSR扩增产物的检测方法主要有两种，分别是银染技术和荧光标记分析技术。郝晨阳等[8]在小麦上详细地分析比较了常规的SSR荧光标记分析技术和银染技术，认为荧光标记分析技术具有更高的灵敏性、更经济、数据收集和处理效率高、数据更准确等优点。高源等[9]利用SSR荧光检测技术用于梨的遗传多样性研究，取得了经济、灵敏、高效的结果。本研究结果也表明，SSR荧光检测技术较传统的银染技术（试验前期研究曾采用过）在扩增条带大小判读识别上明显具有准确性好、效率高等优点。

指纹图谱构建不仅是保护品种资源知识产权、维护生产者和育种家利益的需要，对梨种质资源的管理和利用也具有重要意义。通过本研究，建立起一套基于SSR分子标记的引物组合和鉴定体系标准，并构建了砂梨核心种质的指纹图谱，通过反映不同染色体上的遗传信息，在同一平台上可以同时将数百份甚至上千份的品种资源区分开来，这对于梨科研、教学及生产中的资源收集保存、品种鉴别、品种权保护等都具有十分重要的意义。

参考文献：

[1] 滕海涛，吕 波，赵久然，等.利用DNA指纹图谱辅助植物新品种保护的可能性[J].生物技术通报，2009（1）：1-4.

[2] 张靖国，胡红菊，田 瑞，等.中国砂梨初级核心种质的构建[J].湖北农业科学，2011，50（8）：1590-1592.

[3] TERAKAMI S，KIMURA T，NISHITANI C，et al. Genetic linkage map of the Japanese pear Housui identifying three homozygous genomic regions[J]. J Japan Soc Hort Sci，2009，78（4）： 417-424.

[4] CELTON J M，CHAGN D，TUSTIN S D，et al. Update on comparative genome mapping between Malus and Pyrus[J].BMC Research Notes，2009，2：182.

[5] YAMAMOTO T， KIMURA T， SHODA M，et al. Development of microsatellite markers in the Japanese pear（Pyrus pyrifolia Nakai）[J]. Molecular Ecology Notes，2002，2：14-16.

[6] LIEBHARD R，GIANFRANCESCHI L，KOLLER B，et al. Development and characterisation of 140 new microsatellites in apple （Malus× domestica Borkh.）[J]. Molecular Breeding，2002，10： 217-214.

[7] 陈昌文，曹 珂，王力荣，等.中国桃主要品种资源及其野生近缘种的分子身份证构建[J].中国农业科学，2011，44（10）：2081-2093.

[8] 郝晨阳，王兰芬，贾继增，等.SSR荧光标记和银染技术的比较分析[J].作物学报，2005，31（2）：144-149.

[9] 高 源，田路明，刘凤之，等.TP-M13-SSR技术在梨遗传多样性研究中的应用[J].果树学报，2011，28（3）：394-399.