凝胶法检查穿琥宁注射液细菌内毒素

孟军

摘 要：建立凝胶法检查穿琥宁注射液细菌内毒素的方法。本实验细菌内毒素检查应用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行。选用灵敏度为0.5 EUmL-1的鲎试剂，并用细菌内毒素检查用水将穿琥宁注射液稀释成1∶10浓度的稀释液，进行凝胶法反应实验，结果表明该注射液中所含细菌内毒素对鲎试剂反应无干扰作用。同时将细菌内毒素检查法与家兔法检测结果进行比较，两种方法测定结果相符。以上结果证明细菌内毒素检测方法可以代替家兔法检测穿琥宁注射液的热原。

关键词：穿琥宁注射液 细菌内毒素 凝胶法 鲎试剂 热原

中图分类号：R92 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2015）02（b）-0030-02

Gel Reaction Checking The Bacteria Endotoxin of Potassium Dehydroandrograpolide Succinate Injection

Meng jun

（The Institute of Food and Drug Contro，Tonghua Jilin，134001，China）

Abstract：The method of the determination about the bacteria endotoxin has been established for Potassium Dehydroandrograpolide Succinate injection.The checking of bacteria endotoxin was carried out based on the principle of agglomerate reaction between limulus reagent and bacteria endotoxin.In this experiment，Limulus reagent was selected at sensitivity 0.5EU·mL-1，and Potassium Dehydroandrograpolide Succinate injection was diluted to ten times with the water used for the checking of bacteria endotoxin， then the gel reaction was performed. The results of the experiments indicate that the bacteria endotoxin contained in the injection have no observed interfering with Limulus reagent.Compared with the results determined by cattle rabbit method， the two methods show same results.These results verify that the method of the bacteria endotoxin determination may replace cattle rabbit method to check Potassium Dehydroandrograpolide Succinate injection heating source.

Key Words：Potassium Dehydroandrograpolide Succinate Injection； Bacteria Endotoxin； Limulus Reagent；Heating Source

穿琥宁注射液具有较强的解热作用，对流感病毒甲Ⅰ型、甲Ⅲ型、肺炎腺病毒均有灭活作用，主要与抗生素联合用药治疗病毒性感染，在临床上用于病毒性肺炎，病毒性上呼吸道感染等病症的治疗。目前该药品制剂热原检查主要采用家兔法[1]，但家兔法存在操作繁琐、费时、灵敏度低等缺点，根据《中国药典》2010年版二部附录细菌内毒素检查法凝胶法，我们通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测内毒素，对该制剂进行了细菌内毒素检查方法的探讨和实验，并与家兔法进行了比较，两种方法结果一致。表明以细菌内毒素检查法取代家兔法检测穿琥宁注射液的热原是可行的。

1 仪器与材料

1.1 仪器

旋涡式混悬器（上海精科实业有限公司）；电热恒温水箱（北京医疗设备厂）；微量注射器（北京国营青云仪器厂）；无热原吸头（湛江安度斯生物有限公司，批号131219）。

1.2 材料

鲎试剂（湛江安度斯生物有限公司，灵敏度0.5Eu/mL，批号：130713）；细菌内毒素检查用水（湛江安度斯生物有限公司，规格0.5/支，批号：1306100，内毒素含量≤0.015 EU·mL-1）；细菌内毒素工作标准品（湛江安度斯生物有限公司，规格180Eu/支，批号：2013-3）；穿琥宁注射液（规格：每支2 mL：40 mg；哈药集团三精制药有限公司）3批；热原实验用兔：经吉林省科技厅审批的吉林省通化白山制药厂实验动物场提供，合格证号为006564。

2 方法与结果

2.1 鲎试剂标示灵敏度

（λ）的复核将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在快速混匀器上混和15 min，然后制成2.0、1.0、0.5、0.25λ等系列浓度，按中国药典2010年版二部附录XIE[2]方法操作。反应终点浓度即是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度，标示灵敏度为0.5EUmL-1的鲎试剂符合规定。

2.2 穿琥宁注射液细菌内毒素限值（L）的确定[3]

L=K/M，式中M为本品热原检查剂量1.0mlkg-1[1]，K为细菌内毒素致热阀5.0EUkg-1，本品细菌内毒素理论限值，L=K/M=5/1.0=5.0 EUmL-1。

2.3 供试品的最大有效稀释（MVD）

倍数选用鲎试剂灵敏度（λ）为0.5EUmL-1时，MVD=L/λ=5.0EUmL-1/0.5 EUmL-1=10（倍）

2.4 供试品干扰实验

根据穿琥宁注射液的最大有效稀释倍数，我们用细菌内毒素检查用水将穿琥宁注射液稀释成1∶5及1∶10浓度的稀释液，分别做了干扰试验；将细菌内毒素工作标准品分别稀释成1.0、0.5、0.25、0.125EUmL-1的溶液，取上述溶液每一个浓度0.1 mL，分别加入λ=0.5EUmL-1的0.1 mL的鲎试剂中，在（37.0±1.0）℃水浴中保温（60±2）min。结果，供试品1∶5浓度的稀释液，对细菌内毒素检查有抑制作用，而1∶10浓度的稀释液，对细菌内毒素检查无抑制作用也无增强作用；用检查用水将细菌内毒素工作标准品同上法稀释，与鲎试剂反应，每一浓度平行做4管，重复做3次。结果均相同。干扰实验结果见表1。

表1结果显示，供试品1∶10浓度的稀释液对细菌内毒素检查无抑制作用。

2.5 供试品细菌内毒素检测结果与家兔法检测结果比较

取3批供试品，用细菌内毒素检查用水将穿琥宁注射液稀释成1∶10浓度的稀释液，用灵敏度为0.5EUmL-1的鲎试剂做细菌内毒素检查，同时做阳性对照，阴性对照和供试品阳性对照，按中国药典2010年版附录XIE[2]操作，结果3批样品均为阴性；家兔法热原检查按中国药典2010年版二部附录[4]进行，家兔法检测结果均为阴性；两种检测结果完全一致。

3 结论

穿琥宁注射液的热原检查[1]目前仍采用家兔法，费时，成本高、操作繁琐，影响因素较多。细菌内毒素检查法，具有灵敏度高，操作简便，快速，重现性强等优点。经过实验论证，采用灵敏度为0.5EUmL-1的鲎试剂，以供试品1∶10浓度的稀释液，进行细菌内毒素检查而无干扰，并与家兔法检查结果一致，因此，该法验证了细菌内毒素检查法可用于穿琥宁注射液的内毒素检测。

参考文献

[1] WS-10001-（HD-0016）2002 国家药品标准.

[2] 黄汛，杨洪军，宋雅莲.穿琥宁注射液细菌内毒素检查方法的建立[J].中国药学报，2007（3）：32-33.

[3] 黄清泉，夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计[J].中国药学杂志，1997，2（32）：72.

[4] 中国药典2010年版二部附录Ⅺ E页.

[5] 雒琪，王复馨，李军.凝胶法检查甘露醇注射液细菌内毒素的应用[J].中国医院药学杂志，2003（1）：62-63.

[6] 黄江红，孙华芳，姚佳生，等.硫罗宁注射液细菌内毒素检查方法的建立[J].湖北中医学院学报，2010（2）：22-24.