固相微萃取与低热容气相色谱质谱联用快速分析水中有机磷农药残留量

仪器应用

固相微萃取与低热容气相色谱质谱联用快速分析水中有机磷农药残留量

陶芊

(安捷伦科技(上海)有限公司，上海 200131)

摘要：介绍了一种基于固相微萃取(SPME)技术和5975T低热容(LTM)GC/MS分离分析平台的水中有机磷农残快速测定方法。该方法选用细内径短柱，通过优化分离条件，5975T可在3min内完成对5种常见有机磷农药(毒死蜱，甲基异柳磷，喹硫磷 ，丙溴磷 ，伏杀硫磷)的分离鉴定，相比实验室常规分离方法用时节省90%，联用SPME其方法定量检出限优于5 ng/L。该方法的固相微萃取过程装置简单，操作简便，无需调节萃取体系的离子强度和pH值，20min完成富集，时间/物料成本低廉。同时，还考察了方法的线性范围、精密度和回收率，并对自来水管网水中农药残留进行了分析。

关键词：固相微萃取;低热容气质联用仪;有机磷农药;快速分离分析

作者简介：陶芊，男，1983年生，分析化学博士，主要从事分析仪器研发及相关应用方法开发，E-mail:taoqian@alu.fudan.edu.cn。

DOI:10.3936/j.issn.1001-232x.2015.01.004

收稿日期：2014-06-20

基金项目：国家自然科学

Fast analysis of organophosphorous pesticides in water by SPME and low thermal mass GC/MS.TaoQian(AgilentTechnologies(Shanghai)Co.,Ltd.,Shanghai, 200131,China)

Abstract:A fast method based on solid phase microextraction (SPME) technique and a brand-new analysis platform 5975T (low thermal mass GC/MS) for the analysis of organophosphorous pesticides (OPPs) in water was developed. By using a thin-bore and short column and optimizing the separation condition, 5 OPPs (dursban, isofenphos-methyl, quinalphos, profenofos, phosalone) were separated and identified with 5975T within 3 min, compared with conventional separeation methods to save time 90%. The limits of quantitation of OPPs in water were less than 5 ng/L. The concentration process of SPME was simple and costless. It can be completed in 20 min with no need of adjusting ionic intensity and pH valve. The linear range, repeatability and recovery of the method were studied. The OPPs in pipe water of Pudong district were determined.

Key words：solid phase microextraction (SPME); low thermal mass GC/MS; organophosphorous pesticides (OPPs); fast separation and analysis

1引言

第二次世界大战后，人工合成有机农药开始广泛应用于农业生产。到目前为止，我国每年农药的使用量约在100~130万吨[1]。有机磷农药是最常用的农药，多为磷酸酯类或硫代磷酸酯类，如敌敌畏、乐果、马拉硫磷、甲基对硫磷等。这些化合物有很强的毒性，被吸收后会抑制乙酰胆碱酯酶，使乙酰胆碱积聚，引起毒蕈碱样症状、烟碱样症状以及中枢神经系统症状，严重时可因肺水肿、脑水肿、呼吸麻痹而死亡，重度急性中毒者还会发生迟发性猝死；某些种类的有机磷还会抑制体内神经病靶酯酶(神经毒性酯酶)，并使之"老化"，可在中毒后8～14天引起迟发性神经病。据WHO估计，全世界每年约有20万人死于农药中毒，我国每年有10万人发生急性农药中毒，其中急性有机磷中毒约占一半，病死率达20%。农药残留是指农药使用后残存于环境、生物体和食品中的农药母体、衍生物、代谢物、降解物和杂质的总称。长期食用农药残留超标的农副产品，虽然不会导致急性中毒，但可能引起慢性中毒，导致疾病的发生，甚至影响到下一代。因此有机磷农药是重要的环境污染源。随着雨水的地表径流，有机磷农药逐渐汇入地表水和地下水中，从而严重威胁公众健康。大多数国家都建立了食品和饮用水中农药最大残留量(MRL)，美国环保署(EPA)方法525规定的饮用水中有机磷农药的最大允许含量为0.001到0.25 mg/L；在欧盟(EU)的强制标准中，饮用水中每种农药的最大允许浓度为0.0001 mg/L[2]。为了快速准确地评价饮用水水源和环境水的质量，需要建立高灵敏度的现场检测方法来测定地表水、地下水和饮用水中的有机磷农药含量，从而催生出大量的快速农药残留的检测技术，常见的有化学速测法、免疫分析法、酶抑制法、活体生物测定法和生物传感器法等。然而上述快速检测技术均不同程度的受假阳性高，灵敏度低，使用局限性大，易受干扰等缺点的困扰。为准确测定水样品中有机磷农药残留，大部分分析方法仍是基于色谱技术，采用气相色谱(GC)，配以氮磷检测器(NPD)、火焰光度检测器(FPD)或质谱(MS)检测。但是传统实验室的GC/MS等农残分析技术检测流程慢，分析时间长，样品输送过程带来的不确定性高，给环境监测及食品安全监管部门的工作，特别是应急响应带来许多不便。

5975T LTM-GC/MS是针对户外环境中使用而优化的车载式气质联用仪，紧凑抗震的整体设计具有高机动性而特别适用于现场监测，既减少了样品采集后运回实验室进行分析所需的时间，也大大降低了样品在运输过程中组成与含量发生变化的可能性。在强化移动性的同时，5975T具有与实验室仪器相匹敌的使用温度范围(MAX. 350℃)和质量扫描范围(高达1050u)，相比于市售的其他便携式气质联用仪具有更广的适用范围，不仅可分析挥发性化合物，更可以分析沸点较高的半挥发性化合物。5975T采用低热容快速柱上加热(LTM)技术，相比于传统气浴式柱温箱可大大提高色谱柱升温速度，从而有效提高样品分离速度，缩短分析时间，增加分析通量和仪器效率；同时LTM满功率加热功耗不到传统炉膛的1/4，十分适于常常面临电力紧张尴尬局面的野外实验室。样品前处理方法也是制约现场监测的瓶颈之一。由于法规中农药最大残留量远低于现有质谱检出限，实验室常采用液液萃取和固液萃取的方式对水中有机磷农药进行预富集后再分析，但液液萃取消耗大量溶剂，固液萃取操作繁琐耗时，均不适用于现场分析。固相微萃取(SPME)以涂渍在石英玻璃纤维上的固定相(高分子涂层或吸附剂)作为吸附介质，对目标分析物进行萃取和浓缩，并在气相色谱仪进样口中直接热解吸，是一种集萃取、浓缩、解吸、进样于一体的样品前处理新技术。由于它具有样品用量少、选择性高、使用方便、快捷等优点，自20世纪90年代问世以来[3]，已广泛应用于环境污染物检测，如：农药残留、酚类、多氯联苯、多环芳烃、脂肪酸、胺类、醛类、苯系物等；在食品、医药、临床及法医分析等领域也多有应用[4，5]。本实验初步探讨了SPME与5975T LTM-GC/MS联用快速测定水中残留有机磷农药的方法，以期建立一种简便快捷有效的分析手段，为水中残留有机磷农药的现场调查与检测及相关研究提供有价值的参考依据。

2实验部分

2.1　仪器与试剂

美国Agilent公司5975T LTM-GC/MS系统(图1)由带电子流量控制的分流/不分流进样口、预柱系统、LTM色谱柱系统及质谱检测系统构成。

图1　5975T低热容气质联用仪系统结构示意图

低热容(LTM)柱上快速加热系统(图2)取代了传统笨重的气浴式柱温箱，通过将分析色谱柱与加热丝和温度传感器通过专利工艺直接缠绕，实现柱温的精确测量与控制。

图2　低热容柱上直接加热系统(LTM)结构示意图

100μm PDMS萃取头、萃取手柄购自美国Supelco公司；PC-4200型磁力搅拌台购自CORNING公司；甲醇及100 μg/mL有机磷农药标准品(5种单标：毒死蜱，甲基异柳磷，喹硫磷，丙溴磷，伏杀硫磷，溶剂为甲醇)购自AccuStandard公司(New Haven, USA)；实验纯水由密理博Milli-Q Advantage A-10纯化处理(Billerica, MA, USA)。

2.2　方法

2.2.1样品制备

5种有机磷农药标准品各取200μL配制成20.0μg/mL有机磷农药混标储备液，-20℃冰箱保存。实验时，取储备液在室温下平衡20 min，用甲醇进一步稀释为0.0100，0.0200，0.100，0.500，1.00，2.00，10.0μg/mL，吸取10.0μL不同浓度样品加入10.0mL纯水，形成0-10 ng/mL的标准工作溶液，用于SPME外标定量。

2.2.2SPME萃取及GC进样

移取10.0 mL水样于装有一个小磁转子的小容器瓶(15 mL)中，将此小容器瓶置于磁力搅拌台上的水浴烧杯中，在适宜温度下按照优化速度搅拌。将SPME萃取头插入水样中，精确计时一定时间后取出，将萃取头缩回SPME萃取手柄的针管中，紧接着迅速将针管插入5975T的进样口并推出萃取头，1 min时缩回萃取头并拔出针管。

SPME萃取头每次使用后置于进样口及He气气流中进行清洗，通常处理10 min后即未发现农药残留。

2.2.3气质联用仪测定条件及定性定量方法

(1)色谱条件

色谱柱：HP-5MS LTM(10m×0.18mm×0.18μm)

载气：氦气；进样口温度：260℃；进样方式：脉冲不分流进样，进样口脉冲压力25 psi (0~0.75 min)，1 min后以 100 mL/min 吹扫；柱流量：1.6 mL/min；恒温加热热区温度：260℃；

升温程序：50℃保持0 min，以130℃/min升至180℃，继而以55℃/min升至290℃。

(2)质谱条件

GC/MS接口温度：260℃；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃。

质谱扫描模式：

SCAN(全扫描)，溶剂延迟1.5 min，扫描质量范围40~550 amu，扫描速度2∧1。

SIM(选择离子扫描)，具体条件见表1。

表1　选择离子扫描时间通带及选择离子

(3)定性定量方法

① 全扫描检测模式定性标准;

② 采用全扫描谱库检索的方法定性;

③ 定量计算。

一般以各自基峰离子作为定量离子，基峰离子噪音高的，选择其他丰度较高噪音相对较低的离子为定量离子(表2)。以标准系列浓度为横坐标，标准目标化合物定量离子为纵坐标制作标准曲线；待测目标化合物定量离子峰面积，扣除空白后，与相应目标化合物标准曲线比较定量。

表2　目标化合物定量离子表

3结果与讨论

3.1　色谱柱及方法的选择

色谱柱是实现样品分离的关键部件。根据Van Deemter提出的速率理论，内壁涂渍固定液的毛细管色谱柱由于不存在涡流扩散，可大大提高色谱柱柱效。实验室常用30 m×0.25 mm i.d.的毛细管色谱柱进行农残分析。一般而言，毛细管色谱柱柱效随柱内径变细、柱长变长而提高，但过细过长的毛细管色谱柱会带来柱容量下降、柱头压要求高、分析时间过长等问题，综合考虑现场检测的分析要求，现有商品毛细管色谱柱最符合尺寸要求的是10 m×0.18 mm i.d.的分析柱。在固定相的选择上，现场监测往往会面对各种不同类型的未知样品，虽然DB-1701对农药有更好的分离效果，以具有较广适用性的HP-5MS搭建的现场检测平台显然具有更大的拓展能力。综合考虑，最终确定快速分析柱为LTM HP-5MS 10 m×0.18 mm×0.18 μm i.d.柱系统。

选定分析柱之后，需要对柱流量、柱升温程序进行优化。本实验基于“Japanese positive list”所述方法[6]，采用Agilent公司的气相色谱方法转换软件[7]，可以方便的将适用于30 m×0.25 mm×0.25 μm i.d.色谱柱的方法转换为对应的10 m×0.18 mm×0.18 μm i.d.色谱柱快速方法，再针对所研究的5种有机磷农药样品做适当微调优化(参数详见实验部分)。按该方法对有机磷农药样品分离所得谱图如图3，依次为：选择离子扫描SIM图(用于定量分析)，总离子流TIC图和目标化合物质谱图(用于定性分析)。相比于常规方法，本采用低热容短柱的方法可节约90%的时间；在做序列分析连续进样时，由于10 m LTM柱模块相比于传统炉膛更快的降温平衡速度，在相同时间内分析通量更可提高5倍以上，在户外气源和电力供应受限的情况下，大大提高了仪器的使用效率。

图3　SPME-5975T快速分离有机磷农药选择离子扫描图(SIM)、总离子流图(TIC)及喹硫磷质谱图

3.2　热解吸时间

热解吸时间与GC进样口的温度、萃取物的分配系数以及载气的流速有关，高沸点化合物比低沸点化合物需要更长的解吸时间。解吸不完全不仅会影响方法的灵敏度，而且会污染后续样品，但长时间高温解吸会缩短萃取头的寿命。实验发现，对于表2所列的5种有机磷农药而言，在SPME其他萃取条件相同的前提下，当萃取头在进样口的热解吸时间分别为0.1、0.2、0.5、1 min时考察5种农药响应，其在0.2 min时即趋于完全解吸，同时伏杀硫磷(第五个峰)对丙溴磷(第四个峰)的相对丰度在0.5 min之后趋平(见图4)。为便于操作，并尽可能保持实验条件的一致性，选定热解吸时间为1 min。

图4　热解吸时间对SPME脱附的影响

3.3　萃取条件优化

考察了萃取温度、平衡时间、萃取溶液离子强度、酸碱度和搅拌速度。

萃取温度对有机物在萃取纤维表面上的吸附效率有较大影响，通常溶液温度升高，液体内分子热运动加快，促进吸附平衡加快。但随着温度升高，萃取纤维涂层吸附平衡系数降低。而且温度还将给操作带来不便。本采用电磁加热搅拌器(CORNING PC-420D)对 SPME样品瓶水浴加热，分别考察了不同萃取温度(室温22 ℃，40 ℃，60 ℃)下的萃取效率。实验发现各化合物萃取效率随温度升高变化不一，综合比较后发现在40 ℃时各农药可获得较高的响应(见图5)，故选定萃取温度为40 ℃。

图5　萃取温度对萃取效率的影响

萃取的平衡时间与振荡速度、萃取温度、有机磷农药在溶液中和萃取头之间的分配常数及扩散系数有关，高沸点的化合物比低沸点的化合物需要更长的萃取时间。实验结果表明，峰面积随萃取时间的增加而增大(见图6)。根据Ai等[8]于1997年提出的SPME非平衡理论，采样时不一定要求分析物完全被萃取或一直进行到平衡的建立，只要在严格条件下(完全相同的搅拌方式和速率、萃取时间、萃取头类型等)获得可靠且稳定的响应值与浓度之间的线性关系即可，这亦是定量的一个依据。为缩短分析时间以满足快速响应的要求，综合考虑时间成本和检出灵敏度，本实验选择20 min为萃取时间。

图6　萃取时间与萃取效率的关系

SPME萃取过程中对样品进行搅拌一般有利于使待测组分分布更均匀，更快达到分配平衡。本实验在其他萃取条件都相同的前提下，分别考察了不搅拌、60 rpm、150 rpm、600 rpm和1150 rpm时的萃取效率，其中1150 rpm萃取效率最高(见图7)。显然，在不搅拌的状态下，待测物在水样中的扩散速度较慢，特别是萃取头表面附着一层静态水层，待测物只能通过浓差扩散缓慢到达萃取头，因此萃取量较低；搅拌会破坏静态水层的形成，显著提高萃取量，故选定最高搅拌速率1150 rpm。

图7　搅拌速率与萃取效率的关系

在水样中加入NaCl、Na2SO4等无机盐可增加溶液离子强度，利用“盐析作用”降低有机化合物在水中的溶解度，从而改善萃取效率。加无机盐一般用于顶空方式，对于浸入式加盐易损害萃取头，也易出现干扰峰，因此为简化样品制备过程本实验未添加无机盐。

pH值也会同盐离子浓度一样改变组分在介质和萃取头中的分配系数，由于PDMS萃取头固定相为非离子型聚合物，所以中性的pH值更易被吸附。同时有机磷类农药，遇碱易分解，则应避免过高的pH值。也有研究表明pH在2～12[9]时有机磷农药萃取效率较高且无显著差异，所以本实验也未调整pH值。

3.4　方法的定量检出限、线性及精密度

在选定的萃取条件下，配制浓度从0.0100 ng/mL到10.0 ng/mL的标样，测定其经过萃取后在质谱中的响应。鉴于不同种类的有机磷农药在质谱中的响应因子不同，因而对每种有机磷农药单独以峰面积对样品浓度作图。实验发现，在横跨3个数量级的浓度范围内，萃取峰面积并非随样品浓度呈简单线性递增，较高浓度下萃取效率也较高。因此，为获得更精确的定量结果，在0.010 ng/mL到0.500 ng/mL及0.500 ng/mL到10.0 ng/mL范围内各获得5条外标曲线用以进行定量，相关系数多在0.999以上，按10倍均方根信噪比(RMS S/N)估算方法定量检出限分别为：毒死蜱0.20ng/L，甲基异柳磷4.5 ng/L，喹硫磷 1.4 ng/L，丙溴磷2.1 ng/L，伏杀硫磷1.4 ng/L。另外对于0.100 ng/mL浓度样品进行4次平行测试来验证方法的重现性/精密度。由表3可看出，对于不同化合物，方法重复性在3.6%~14.0%之间，结果是稳定的。方法的回收率采用SPME定量方法中常用的相对回收率进行验证，通过在空白水样中加标，利用SPME富集，5975T-LTM-GC/MS检测并依据标准曲线计算获得加标样品的浓度，实验测得的浓度与实际浓度的比值为每种有机磷农药的相对回收率，表3实验结果表明5种目标化合物的相对回收率在78%~85%之间，符合农残测定要求。方法的线性相关系数，线性范围，重现性及回收率见表3。

表3　方法的线性范围、重复性和回收率(n=4)

3.5　自来水管网水中有机磷农残检测

在选定的实验条件下，将SPME与5975T-LTM-GC/MS联用，对上海浦东外高桥地区自来水管网水取样并测定其中有机磷农药残留量分别是：毒死蜱1.8 ng/L，丙溴磷含量低于其方法定量检出限(约2.0 ng/L)，未检出甲基异柳磷、喹硫磷和伏杀硫磷(图8)，远低于国家生活饮用水卫生标准[10]。

图8　自来水管网水中有机磷农药残留选择离子扫描(SIM)谱图

4结语

本研究建立了SPME与5975T-LTM-GC/MS联用快速分析水中有机磷农药残余的方法，采用10m×0.18μm细内径短分析柱，利用国际先进的低热容柱上加热模块的快速升温特点，分析仅需3 min，相比于常规方法可节约90%的时间；在做序列分析连续进样时，由于10 m LTM柱模块相比于传统色谱炉膛更快的降温平衡速度，在相同时间内分析通量更可提高5倍以上，在户外气源和电力供应受限的情况下，可极大提高仪器的使用效率；优化建立的固相微萃取(SPME)操作简单流程短，易于在户外环境中实现且灵敏可靠，通过20min富集即可获得优于5 ng/L的定量检出限，远低于最苛刻的欧盟强制标准，有力支持现场执法与应急决策，保障人民用水安全。该方法集样品富集、分离、分析于一体，是快速分析水中有机磷农药残余的有效手段。

参考文献

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[2]蔡敏，邹云.饮用水中痕量有机磷农药的快速分析方法安捷伦科技出版物，5990-3158CHCN，2008年11月

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[5]胡国栋.固相微萃取技术的进展及其在食品分析中应用的现状色谱，2009，27(1)：1-8.

[6]日本厚生省，The method for multi-residue analysis of pesticides in agricultural products by GC/MS.http://www.mhlw.go.jp

[7]安捷伦公司Agilent 7890B/5977A GC/MSD的集成智能化功能助推生产力、降低运行成本安捷伦科技出版物，5991-1840CHCN，2013年1月.

[8]Ai J. Headspace solid phase microextraction dynamics and quantitative analysis before reaching a partition equilibrium. Anal Chem， 1997，69：3260-3266.

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[10]GB5749-2006，生活饮用水卫生标准.