新疆维族、汉族COPD易感性与ADAM33基因F+1、V4位点多态性的关系

新疆维族、汉族COPD易感性与ADAM33基因F+1、V4位点多态性的关系

王珊1，关键1，安瑞芬2，王莎莎1，许西琳1

(1石河子大学医学院第一附属医院,新疆石河子832008；2伊犁哈萨克自治州新华医院)

摘要：目的探讨新疆维族、汉族慢性阻塞性肺疾病(COPD)易感性与解整合素-金属蛋白酶33(ADAM33)基因F+1、V4位点多态性的关系。方法收集200例维族吸烟COPD患者(维族病例组)和211例维族吸烟健康者(维族对照组)；199例汉族吸烟COPD患者(汉族病例组)和210例汉族吸烟健康者(汉族对照组)外周血标本，使用酚氯仿法提取DNA，运用美国生物应用系统公司(ABI)SNaPshot SNP分型技术检测ADAM33基因F+1、V4位点单核苷酸多态性。采用方差分析分析两民族病例组ADAM33基因F+1、V4位点基因型与肺功能相关临床指标的关系。结果维族、汉族病例组和对照组F+1位点CC、CT、TT 3种基因型分布和C、T等位基因分布频率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；V4位点GG、CG、CC 3种基因型分布和C、G等位基因分布频率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。维族病例组F+1、V4位点各基因型间第一秒用力呼气容积占预计值的百分比(FEV1% pred)、第一秒用力呼气容积占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC)比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；汉族病例组V4位点GG基因型较其他基因型FEV1% pred、FEV1/FVC差异有统计学意义(P均<0.05)；F+1位点3种基因型间肺功能比较差异无统计学意义(P均>0.05)。结论新疆维族、汉族COPD易感性与ADAM33基因F+1、V4位点多态性无关，汉族COPD患者V4位点GG基因型较其他基因型有更低的FEV1% pred、FEV1/FVC。

关键词：慢性阻塞性肺疾病；解整合素-金属蛋白酶33；多态性；单核苷酸；维吾尔族；汉族；新疆维吾尔自治区

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.006

中图分类号：R563 文献标志码：A

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81360009)。

作者简介：第一王珊(1990-)，女，在读硕士，主要研究方向为呼吸系统疾病。E-mail: 1245281784@qq.com

作者简介：通信关键(1968-)，男，主任医师，博士，主要研究方向为慢性阻塞性肺疾病。E-mail: Guanjian6@163.com

收稿日期：(2015-08-10)

Association between polymorphisms of F+1 and V4 locus in ADAM33 gene and susceptibility

to COPD in Xinjiang Uygur and Han population

WANGShan1, GUAN Jian, AN Rui-fen, WANG Sha-sha, XU Xi-lin

(1TheFirstAffiliatedHospitalofMedicalSchool,ShiheziUniversity,Shihezi832008,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the association between polymorphisms of F+1 and V4 locus in a disintegrin and metalloprotease domain 33 (ADAM33) gene and susceptibility to chronic obstructive pulmonary disease (COPD) in Xinjiang Uygur and Han population. MethodsThe peripheral blood samples from 200 cases of COPD patients and 211 cases of healthy controls in smoking Uygur population and 199 cases of COPD patients and 210 cases of healthy controls in smoking Han population were collected. DNA was extracted. The single nucleotide polymorphism of F+1 and V4 (ADAM 33 gene) was detected by ABI SNaPshot SNP genotyping. Variance analysis was used to analyze the association between F+1,V4 genotypes in ADAM33 gene and clinical indicators of lung function in patients between Uygur and Han population. ResultsThere were no significant differences in the frequencies of F+1 locus CC, CT, TT genotypes and C, T alleles between the patient group and control group in Xinjiang Uygur and Han population (all P>0.05). There were no significant differences in the frequencies of V4 locus GG,CG,CC genotypes and G, C alleles between the patient group and control group in Xinjiang Uygur and Han population (all P>0.05). In the Uygur patient group, there were no significant differences in the percentage of forced expiratory volume in one second (FEV1)/the predicted value (FEV1% pred) and the percentage of forced expiratory volume in one second/forced vital capacity (FEV1/FVC) between different genotypes of F+1,V4 locus (all P>0.05). In the Han patient group, there were significant differences in the percentage of FEV1% pred and FEV1/FVC of V4 locus GG genotype (P<0.05). There were no significant differences in three genotypes of F+1 locus and clinical indicators of lung function (all P>0.05). ConclusionsThere is no significant correlation between the polymorphisms of F+1, V4 locus of ADAM 33 gene and the susceptibility to COPD in Xinjiang Uygur and Han population. COPD patients with V4 GG genotype have much lower FEV1% pred and FEV1/FVC than that of the other genotypes in Han population.

Key words: chronic obstructive pulmonary disease； a disintegrin and metalloprotease domain 33； polymorphism； single nucleotide； Uygur nationality； Han nationality; Xinjiang Uygur autonomus region

慢性阻塞性肺疾病(COPD)与气道及肺组织对有害气体或颗粒(烟草烟雾等)的慢性炎症反应异常增高相关[1]。吸烟是影响COPD发展的重要风险环境因素，近90%的COPD患者由长时间吸烟引起，但仅有25%的长期重度吸烟者发展为有症状的COPD[2]。个别地区或民族COPD 较高或较低的发病率，均不能证明该地区或民族生活方式中的危险因素或吸烟程度要高于或低于另一地区或另一民族，这提示两者间存在某些基因的差异决定了COPD 发病率的差别。目前已有大量研究表明，基因多态性与COPD易感性有关。国内外学者普遍认为解整合素-金属蛋白酶33(ADAM33)基因活性改变是气道高反应性及气道重塑中成纤维细胞和平滑肌细胞发生功能异常的基础，与哮喘、气道高反应性(AHR)及肺功能下降相关，而气道重塑和气道炎症及肺功能下降与COPD密切相关。目前大量研究证实ADAM33与COPD易感性存在相关性。2014年1月～2015年6月，我们探讨ADAM33基因F+1、V4(rs511898、rs2787094)位点多态性( SNPs)与新疆维吾尔族、汉族人群吸烟COPD易感性相关性，并分析不同基因型对吸烟COPD患者肺功能的影响。

1资料与方法

1.1临床资料吸烟COPD患者399例,入选标准参考我国中华医学会呼吸病学分会制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)》。COPD肺功能标准：第一秒用力呼气容积占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC)<70%。本研究纳入维族吸烟COPD患者200例(维族病例组)，男112例、女88例，年龄(61.22±12.74)岁，吸烟指数(470.93±25.86)支/年，BMI(25.16±4.15)kg/m2,FEV1占预计值的百分比(FEV1% pred)为(51.83±13.12)%,FEV1/FVC(54.73±10.78)%。汉族吸烟COPD患者199例(汉族病例组)，男159例、女40例，年龄(61.59±13.49)岁，吸烟指数(512.14±27.08)支/年，BMI(23.78±3.60)kg/m2,FEV1% pred为(60.32±12.91)%,FEV1/FVC为(61.96±7.84)%。同期选取211例维族、210例汉族吸烟健康体检者分别纳入维族对照组和汉族对照组，维族对照组中男134例、女77例，年龄(59.29±10.36)岁，吸烟指数(444.24±23.88)支/年，BMI为(24.83±2.87)kg/m2,FEV1% pred为(81.72±10.77)%,FEV1/FVC为(82.93±7.75)%。汉族对照组中男169例、女41例，年龄(59.79±10.18)岁，吸烟指数(468.48±27.47)支/年，BMI为(23.95±3.32)kg/m2,FEV1% pred为(78.08±13.09)%,FEV1/FVC为(80.49±8.26)%。病例组、对照组均排除胸廓畸形、胸部手术史，所有人员经详细病史询问、体格检查、胸部X线片和肺功能测定等检查除外肺癌、肺栓塞、支气管扩张、肺结核、间质性肺疾病、支气管哮喘等呼吸系统疾病，并排除有近期手术史、感染性疾病、明显心功能不全、自身免疫性疾病、严重的内分泌、肾脏或肝脏病史患者。本研究经石河子大学医学院第一附属医院医学伦理委员会批准，入选对象均签署知情同意书。两民族对照组、病例组间性别、年龄、吸烟指数、BMI比较差异均无统计学意义，而FEV1% pred、FEV1/FVC比较差异有统计学意义(P<0.05)。

1.2ADAM33基因F+1、V4位点多态性检测采集入选对象外周静脉血5 mL，加入EDTA抗凝管中，使用酚氯仿法提取DNA，置于-80 ℃保存检测。根据GenBank提供的基因序列，在线Primer3软件设计引物，运用SNaPshot进行分型；对分型结果进行双盲样本质控和阴性对照质控，HWE质检及MAF合理性的质检。SNaPshot反应过程中SNaPshot多重单碱基延伸反应延伸引物序列:F+1:TTTTTCTATAGCCCTCCAAATCAGAAGAGAC；V4：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGACTGAGTC-CACACTCCCCTG。PCR扩增反应：1 μL样本DNA和1 μL多重PCR引物。多重PCR反应采用Touch-down PCR反应程序，PCR扩增后，取PCR反应产物1.5 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，有目的片段则提示扩增实验成功。PCR产物纯化：在10 μL PCR产物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease I酶，37 ℃温浴1 h, 然后75 ℃灭活15 min。SNaPshot多重单碱基延伸反应：在10 μL 延伸产物中加1 U SAP酶，保温(37 ℃)1 h，后灭活(75 ℃)15 min。延伸产物测序：取0.5 μL纯化后的延伸产物，与0.5 μL Liz120 SIZE STAN-DARD，9 μL Hi-Di Formamide混匀，总体积10 μL，95 ℃变性5 min后上ABI3730XL测序仪。运用GeneMapper4.1软件分析ABI3730XL测序仪上收集的原始数据。

1.3统计学方法采用SPSS20.0统计软件。组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。采用χ2检验分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。采用χ2检验分析同民族病例组与对照组的F+1、V4位点基因型和等位基因频率是否存在差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1ADAM33基因F+1、V4位点电泳产物结果F+1位点PCR扩增产物为一长278 bp的DNA 片段；V4位点PCR扩增产物为一长313 bp的DNA 片段。

2.2两民族对照组与病例组基因型及等位基因频率分布比较维族、汉族F+1、V4位点(rs511898、rs2787094)的基因型频率均符合Handy-Weinberg遗传平衡定律，证明所收集的两民族研究样本的群体代表性良好。同民族病例组与对照组中F+1、V4位点的基因型及等位基因频率分布比较均无明显差异(P>0.05)，见表1、2。

2.3两民族病例组ADAM33基因F+1、V4位点基因型与肺功能的关系维族病例组：F+1及V4位点各基因型间FEV1% pred、FEV1/FVC比较差异均无统计学意义。汉族病例组：V4位点3种基因型间FEV1% pred、FEV1/FVC比较有显著差异(P<0.05)；F+1位点3种基因型间肺功能比较无统计学差异。见表3、4。

表1　维族对照组与维族病例组F+1、V4位点基因型及等位基因频率分布比较[例]

表2　汉族对照组与汉族病例组F+1、V4位点基因型及等位基因频率分布比较[例]

表3　维族病例组ADAM33基因F+1、V4位点基因型与肺功能的关系

表4　汉族病例组ADAM33基因F+1、V4位点基因型与肺功能的关系

3讨论

ADAM33基因位于第20号染色体的短臂13号位(20p13)，编码一种基质金属蛋白酶，包含813个氨基酸，在间充质细胞中选择性表达。ADAM33基因除锌结合位点，还有钙结合位点，具有高度判别底物特异性的功能[3～5]。2002年Van Eerdewegh等[6]研究首次显示ADAM33基因的SNPs及其单倍型与哮喘发生和AHR呈显著相关,确定ADAM33基因是哮喘易感基因。2005年van Diemen等[7]提出ADAM33基因单核苷酸多态性与肺功能下降相关，而气道重塑和气道炎症及肺功能下降及COPD密切相关，由此推测ADAM33基因SNPs同样参与了COPD的发病机制及病程进展。Gosman等[8]研究发现，ADAM33基因4个位点(S2、T1、T2、ST + 5)与COPD的发病相关。Sadeghnejad 等[9]研究发现，ADAM33基因的5个位点(Q-1, S1, S2, V1 和V4)与长期吸烟患者COPD及肺功能下降相关。Wang等[10]研究发现,ADAM33基因4个位点(V4, T2, T1 和 S1)与COPD易感性明显相关。张伟兵等[11]研究发现，ADAM33与吸烟COPD人群发病相关，并影响COPD患者肺功能。蒋涛等[12]研究发现，ADAM33基因2个位点(V4、S1)与新疆哈萨克族人群COPD易感性明显相关。迟令福等[13]研究发现，ADAM33基因F+1位点与山西地区汉族COPD患者发病相关。Tan等[14]研究发现，ADAM33基因S1、S2、Q-1和F+1位点与COPD的易感性有一定关联。覃洁等[15]研究发现,ADAM33基因的S2、F+1、V4位点与内蒙古镶黄旗地区蒙古族COPD有相关性。Zhou等[16]研究发现，ADAM33基因T1、T2、S1、Q-1、F+1、ST+5位点与COPD的发生相关。上述研究结果表明目前国内外对不同地域、不同人群F+1、V4位点与COPD的发生有无相关性仍未得出一致结论。

新疆是一个多民族人群聚居区，维吾尔族对于新疆各少数民族基因多态性和基因易感性的研究更具代表性。本研究采用病例对照研究方法，以中国新疆维吾尔族、汉族人群吸烟COPD患者和健康吸烟个体为研究对象，对ADAM33基因F+1、V4位点单核苷酸多态性与新疆维吾尔族、汉族人群中COPD易感性相关性进行研究，并分析不同基因型对吸烟COPD人群肺功能的影响。本研究未发现ADAM33基因F+1、V4位点单核苷酸多态性与新疆维族、汉族人群吸烟COPD发病具有相关性。同时分析病例组ADAM33基因F+1、V4位点基因型肺功能指标之间的关系，结果表明维族F+1、V4位点各基因型间FEV1% pred、FEV1/FVC比较均无统计学意义；汉族V4位点3种基因型间FEV1% pred、FEV1/FVC比较有显著差异, 而F+1位点3种基因型间肺功能比较均无明显差异，提示汉族COPD患者V4位点GG基因型较其他基因型有更低的FEV1% pred、FEV1/FVC，说明ADAM33基因V4GG基因型对汉族COPD患者的肺功能有影响。当ADAM33基因上发生碱基的转换或替换时，可能会导致氨基酸序列产生变化，影响蛋白质功能，刺激气道导致间质细胞的增殖分化，亦可通过外基质与间充质细胞黏附，增加间充质细胞的迁移力、延展性，过多地表达胶原纤维及平滑肌纤维参与气道重塑，本研究可证实ADAM33影响吸烟汉族COPD的肺功能。

本实验得出ADAM33基因F+1、V4位点单核苷酸多态性与新疆维族、汉族人群吸烟COPD易感性可能无关，仍需在相同民族人群中扩大样本量进行更深入研究。

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