气道上皮细胞衍生的胰岛素样生长因子触发偏移CD8+T细胞极化

黄邵洪，李　昀，覃　杰，安　军，张军航，荣　健

(中山大学附属第三医院1.胸心外科、2.放射科，广东 广州　510630；3.中山大学附属第一医院麻醉科，广东，广州　510089)

气道上皮细胞衍生的胰岛素样生长因子触发偏移CD8+T细胞极化

黄邵洪1，李昀1，覃杰2，安军1，张军航1，荣健3

(中山大学附属第三医院1.胸心外科、2.放射科，广东 广州510630；3.中山大学附属第一医院麻醉科，广东，广州510089)

中国图书分类号：R322.35；R329.25；R392.12；R977.6

摘要:目的探讨气道上皮细胞衍生的胰岛素样生长因子(IGF1)对CD8+T细胞极化的影响。方法人气道上皮细胞株RPMI2650与鼠过敏原Der p1共培养72 h，用定量PCR及Western免疫印迹检测其IGF1表达情况。将前述上皮细胞、重组IGF1和IGF1抗体分别加入抗体激活的CD8+T细胞中培养，用流式细胞仪检测细胞凋亡。检测Der p1活化的上皮细胞及IGF1对CD8+T细胞p53基因甲基化及表达的影响。结果加入Der p1共同孵育后，RPMI2650细胞IGF1mRNA(23.1%±5.2% vs 5.2%±2.3%，P<0.01)和蛋白表达(33.4±6.4 vs 9.2±4.6，P<0.01)均明显增加。将CD3/CD28抗体激活的CD8+T细胞与Der p1活化的上皮细胞共培养，凋亡细胞增加的趋势被抑制(41.7%±8.2% vs 5.2%±1.8%，P<0.01)。直接加入重组IGF1有同样效果，而IGF1抗体能阻断该效应。Der p1活化的上皮细胞能抑制活化CD8+T细胞p53基因mRNA(29.1%±5.9% vs 16.2%±4.3%，P<0.01)和蛋白表达(63.3±8.9 vs 26.9±5.6，P<0.01)，加入IGF1抗体后这种作用消失。重组IGF1使CD8+T细胞p53基因甲基化增加。结论Der p1蛋白能够诱发RPMI2650细胞产生IGF1，后者通过诱导p53基因甲基化抑制CD8+T细胞凋亡。

关键词:气道上皮细胞；胰岛素样生长因子；p53基因；甲基化；CD8+T细胞；凋亡

偏移的CD8+T细胞极化在许多免疫异常反应中起重要作用，比如风湿性关节炎[1]、糖尿病[2]和颅内感染[3]。在哮喘发生中，CD8+T细胞极化同样起重要作用，但何种原因导致其极化并不清楚[4]。

胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-1,IGF1)又称为生长调节素C(somatomedin C)，促进生长和防止细胞死亡。IGF1在人的一生中都发挥作用，尤其是在儿童期和青春期。IGF1主要由肝脏产生，通常是生长激素启动的后续信号。IGF1也是一些过敏性疾病(如哮喘)的发病因素之一。嗜碱性粒细胞表达IGF1受体，当暴露于IGF1后，前者被激活并释放胞内颗粒[5]。小鼠气道过敏模型中检出IGF1高表达[6]，还有学者认为IGF1对未成熟的肺成纤维细胞有促进α平滑肌表达和胶原蛋白合成的作用，这将导致肺纤维化(由核因子κB转录介导)[7]。除肝脏外，IGF1还可由气道炎症细胞产生，但具体是何种类型细胞尚不清楚[8]。

被激活后T细胞通过凋亡进入激活诱导的细胞死亡(activation-induced cell death, AICD)，维持机体免疫平衡。作为死亡信号受体的Fas基因及其配体FasL，在T细胞被激活后表达上调，Fas/FasL相互作用下启动细胞凋亡[9]。除了Fas/FasL通路外，还有其他分子在凋亡启动中发挥作用，如p53蛋白。尽管p53蛋白主要是诱导肿瘤细胞凋亡，其他细胞中也有表达，氮芥诱导的小鼠皮肤细胞凋亡和炎症反应，这一过程就是依赖p53基因表达的[10]。紫外线照射诱导人角质细胞调节ERK1/2和血栓调节素表达就是由p53基因介导的[11]。然而，p53基因在CD8+T细胞AICD过程，尤其是偏移CD8+T细胞极化中的作用尚不清楚。我们发现，过敏性刺激使小鼠气道上皮细胞表达IGF1，这种上皮细胞产生的IGF1抑制CD8+T细胞p53表达，参与抗原特异性的CD8+T细胞极化过程。

1材料与方法

1.1试剂IGF1及p53抗体购自Santa Cruz Biotech上海分公司；定量qRT-PCR及Western免疫印迹试剂购自Invitrogen上海分公司；Der p1蛋白购自MyBiosource公司(San Diego, CA)；颗粒酶B及穿孔素ELISA套件购自R&D Systems上海分公司；膜联蛋白Annexin V套件购自Sigma Aldrich上海分公司；免疫细胞分离提取套件购自Miltenyi Biotech上海分公司；DNA纯化套件购自Promega北京分公司；EpiXploreTM甲基化检测套件购自Clontech北京分公司。

1.2细胞培养人鼻腔上皮细胞株RPMI2650购自美国细胞培养协会(American Type Culture Collection，ATCC, Manassas, VA, USA)，置于DMEM细胞培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)培养，加入10%小牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素及200 mmol·L-1谷氨酸。培养箱条件为37℃恒温，含5% CO2。

1.3定量实时PCR(qRT-PCR)细胞总RNA通过TRIzol reagents试剂盒提取。cDNA由逆转录试剂盒合成。qRT-PCR由MiniOpticon实时PCR系统(Bio-Rad Life Science公司, 上海)完成。研究所用引物为：IGF1 (NCBI: NM_001111283), 正向:3′-TCTGAATCTTGGCTGCTGGA-5′，反向: 3′-TGTGCTTCTTGACGACTTGC-5′；p53 (NCBI: AB082923), 正向:3′-TGGCCATCTACAAGCAGTCA-5′，反向: 3′-GGTACAGTCAGAGCCAACCT-5′。结果用内参β-actin相对量表达。

1.4Western免疫印迹细胞总蛋白提取后由SDS-PAGE凝胶电泳分离，再转印至硝酸纤维膜上。经5%脱脂牛奶孵育封闭后加入一抗(100~500 μg·L-1)，室温下孵育1 h后，加入辣根过氧化物酶结合二抗继续孵育1 h。每次孵育完成后，用缓冲液(Triton X-100)冲洗多余抗体。免疫反应结束后生成化学发光底物，并由X射线胶片成像。胶片成像后由系统自带图像软件量化免疫印迹密度。

1.5流式细胞计数细胞经荧光标记的一抗染色后由流式细胞计数仪(FACSCanto II，BD Bioscience，上海分公司)计数。凋亡细胞通过Annexin V套件染色后检测。死亡细胞由碘化丙啶(propidium iodide，PI)5 mg·L-1, 15 min染色后检测计数。

1.6CD8+T细胞纯化由健康志愿者获得外周血标本(每人20 mL)，实验及血样采集经我院伦理委员会批准。经梯度离心获得外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)。通过免疫磁珠细胞分离套件将PBMC中CD8+T细胞及CD11c+树突状细胞(dendritic cells，DC)分离，并经流式细胞仪检测，CD8+CD25-T细胞及DC纯度均超过98%。

1.7抗原特异性CD8+T细胞多克隆增殖的评估将CD8+CD25-T细胞用琥珀酰亚胺酯(carboxy fluorescein succinimidyl ester，CFSE)标记，置于2 mg·L-1CD3抗体和5 mg·L-1CD28抗体包被环境下培养72 h。T细胞增殖率通过CFSE稀释法测定。

1.8抗原特异性CD8+T细胞激活的评估将CD8+CD25-T细胞置于Transwell底层小室中培养，间隔层为RPMI2650细胞株。Der p1蛋白(盐水作为对照或加入抗IGF1中和抗体200 μg·L-1)置于顶层小室，浓度为30 μg·L-1，孵育72 h。收获CD8+T细胞并用CFSE标记，加入DC细胞(T细胞 ∶DC=5 ∶1)，在30 μg·L-1Der p1蛋白或小牛血清蛋白中培养72 h。CD8+T细胞增殖率通过CFSE稀释法测定。培养液中颗粒酶B及穿孔素水平由相应ELISA试剂盒检测。

1.951铬(51Cr)释放检测激活的CD8+T细胞用51Cr释放检测法分析。以结肠癌细胞株T84作为靶细胞，用51Cr标记孵育2 h。冲洗后将T84细胞(108·L-1)和CD8+T细胞(108·L-1)置于Transwell底层小室中。间隔层为RPMI2650细胞(109·L-1)。底层小室上清液每4 h收集一次75 μL。51Cr活性由γ射线计数器(Perkin Elmer公司，美国)测定，最大释放量和自发释放量分别通过加入2% Triton X-100和培养液获得。CD8+T细胞激活产生的51Cr特异性释放量由以下公式计算：(A-B)/(C-B)×100%，A：实际测定量，B：自发释放量，C：最大释放量。

1.10p53基因甲基化测定将纯化的DNA用EpiXploreTM甲基化检测套件进行亚硫酸盐转化后，进行甲基化测定。p53基因的引物序列分别为：(1)甲基化引物，正向:3′-ATTTTAGTGGTAATTTATTGGGACG-5′，反向: 3′-TAATAAAACTCCCCTTTCTTACGAA-5′；(2)非甲基化引物，正向:3′-TTTTAGTGGTAATTTATTGGGATGG-5′，反向: 3′-TAATAAAACTCCCCTTTCTTACAAA-5′。

2结果

2.1Der p1蛋白诱导气道上皮细胞生成IGF1气道上皮细胞能够产生IGF1[12]，但其触发生成的诱因尚未明确。我们同时检测了IGF1在人气道上皮细胞(RPMI2650细胞)基线水平的mRNA(Fig 1A)和蛋白(Fig 1B-C)水平的表达量，二者在暴露于Der p1后均明显增加，并且这种增加具有剂量依赖性(Fig 1)。该结果提示：鼠致敏原能上调人气道上皮细胞IGF1表达。

Human airway epithelial cell line RPMI2650 cells, was cultured in the presence or absence of a mite allergen, Der p1, for 72 h. A: The bars indicate the levels of IGF1 mRNA; B: The immune blots indicate the IGF1 protein levels. The bars below the blots indicate the summarized integrated density of the blots. BSA is an irrelevant control protein (50 μg·L-1); C: The bars indicate the cell counts from day 0 to day 3.**P<0.01vsBSA group (A, B), or day 0 group (C).

2.2气道上皮细胞生成的IGF1抑制CD8+T细胞AICD尽管偏移CD8+T细胞极化在气道过敏性疾病发生中起作用[13]，但上皮细胞表达的IGF1是否对CD8+T细胞极化有作用尚不清楚。我们发现，原始CD8+T细胞能够被CD3/CD28抗体激活，表现为CD8+T细胞增殖(Fig 2A)，同时激活的CD8+T细胞中存在大量凋亡细胞(Fig 2B-C)。在混合培养液中，盐水对照组中凋亡CD8+T细胞处于低水平(Fig 2B、2Ca)，加入CD3/CD28抗体激活后凋亡CD8+T细胞明显增加(Fig 2B、2Cb)。加入Der p1孵育的上皮细胞后，凋亡细胞增加的趋势被抑制(Fig 2B、2Cc)，而加入未经处理的上皮细胞则无此效果(Fig 2B、2Cd)。该结果提示，气道上皮细胞生成的IGF1会抑制CD8+T细胞AICD过程。为进一步证实该想法，我们在上述实验中加入IGF1抗体，发现Der p1孵育上皮细胞对CD8+T细胞凋亡抑制作用被阻断了(Fig 2B、2Ce、2Cf)，加入重组IGF1进一步证实了该结果(Fig 2B、2Cg)。

2.3气道上皮细胞生成的IGF1通过MEK-ERK通路诱导CD8+T细胞p53基因甲基化p53基因产物能够诱导细胞凋亡，由此我们进一步确定IGF1是否通过该途径抑制CD8+T细胞AICD[14]。我们利用实验Fig 2中部分细胞，检测其生成的IGF1能否调节CD8+T细胞p53蛋白表达。定量PCR和Western免疫印迹均显示CD8+T细胞p53蛋白表达。以CD3/CD28抗体激活后，CD8+T细胞p53蛋白表达明显增加， Der p1孵育的RPMI2650细胞能抑制该趋势，而加入IGF1抗体后这种作用消失(Fig 3A-B)。由此可见，激活CD8+T细胞将使p53蛋白表达增加，而上皮细胞生成的IGF1则可以阻断该过程。

为阐明IGF1抑制CD8+T细胞p53表达的机制，我们进行了甲基化特异性PCR检测。结果显示，在原始CD8+T细胞中，p53基因存在部分甲基化，而在暴露于重组IGF1后，这一比例明显增加。在MEK-ERK缺乏CD8+T细胞中则未观察到该现象(Fig 3C)。Western免疫印迹显示，IGF1处理后的CD8+T细胞Bcl-2和Bcl-xL蛋白水平并无明显变化(Fig 3D-E)。

2.4Der p1蛋白诱导的气道上皮细胞激活的CD8+T细胞具有Der p1特异性免疫反应气道上皮细胞表达MHC I和MHC II[15]及B7分子，并将抗原呈递给T细胞[14]。为了明确气道上皮细胞生成的IGF1能否作为抗原特异性偏移CD8+T细胞极化的启动因子，我们将原始CD8+T细胞和Der p1蛋白诱导的气道上皮细胞共同孵育48 h。将获得的CD8+T细胞置于特异性抗原Der p1环境下，加入新鲜提取的DC共孵育72 h。特异性CD8+T细胞出现明显增殖，加入IGF1中和抗体后增殖被抑制(Fig 4A)。

Fig 2　Epithelial cell-derived IGF1 reduces AICD of CD8+ T cells

A: The histograms indicate the proliferation of CD8+T cells; B: The bars indicate the frequency of dead CD8+T cells and apoptotic CD8+T cells in the activated CD8+T cells; C: The dot plots indicate the frequencies of PI+or/and Annexin V+CD8+T cells.**P<0.01vsgroup a.

Naïve CD8+T cells were treated in the same procedures of Fig 2C, the bars (A) and immune blots (B) indicate the levels of p53 in CD8+T cells.**P<0.01vsgroup a. C：The p53 gene methylation results. M: Methylated； U: Un-methylated； rIGF1: Recombinant IGF1； U0126: The MEK-ERK inhibitor; LY294002:The PIK3-Akt inhibitor. BSA is an irrelevant protein using as a control; Anti-CD3/CD28: CD8+T cells were treated with anti-CD3/CD28 antibodies. D and E: The immune blots indicate the protein contents of Bcl-2 (D) and Bcl-xL (E) in the CD8+T cell extracts.

培养液中细胞毒因子、颗粒酶B(Fig 4B)及穿孔素(Fig 4C)水平明显升高。该结果提示，气道上皮细胞生成的IGF1能够触发抗原特异性CD8+T细胞极化。CD8+T细胞的激活通过特异性溶解反应得到证实(Fig 4D)。

3讨论

Fig 4　Epithelial cell-derived IGF1 induces CD8+ T cell polarization

A~F：The histograms indicate the frequency of CD8+T cell proliferation; A~B: Without the presence of epithelial cells; C~E: In the presence of epithelial cells; F: Staining controls; G~I: The bars indicate the levels of granzyme B (G), perforin (H) and specific lysis (I). The labels of x axis are the same as the labels of histograms.**P<0.01vsgroup A.

许多免疫系统异常或多或少都与偏移CD8+T细胞极化相关。本研究显示气道上皮细胞(RPMI2650细胞)，能够在鼠过敏原Der p1蛋白作用下产生IGF1。而这种气道上皮细胞生成的IGF1将使p53基因发生甲基化，进而抑制CD8+T细胞的凋亡进程，促成CD8+T细胞极化。

鼠过敏原在许多过敏性疾病发生过程中扮演重要角色。除了作为通常意义下的过敏原外，它们中的一些亚型(如Der p1)具有蛋白酶样作用，能够影响上皮细胞紧密连接处的完整性，并且能够激活蛋白酶活化受体2，从而破坏上皮屏障功能[16]。我们的研究提供了进一步证据：Der p1能够诱导RPMI2650细胞生成IGF1。IGF1通常是由肝细胞生成的，但其他细胞(如气道组织中的炎症细胞)也可以产生[8]。

AICD是一种T细胞的正常激活反应。这种过程在T细胞被激活后就启动并诱导凋亡，AICD在维持机体免疫系统稳定中意义重大。AICD是由Fas受体(Fas，CD95)和Fas配体(FasL，CD95 ligand)相互作用下诱导的细胞凋亡。机体许多(免疫耐受)重要器官，如睾丸、大脑、角膜等，其细胞均有FasL高表达,用以抑制免疫反应对这些器官可能造成的损伤。这就不难理解如果AICD机制出现异常，会发生多种自身免疫疾病。本研究显示，被CD3/CD28抗体激活后凋亡CD8+T细胞明显增加，而气道上皮细胞生成的IGF1使凋亡和死亡细胞数减少。加入IGF1中和抗体后，减少CD8+T细胞凋亡的作用被抑制，再加入重组IGF1又可恢复这种抑制作用。其他学者也发现IGF1能够抑制细胞凋亡[17-18]。

p53基因作用缺失会造成许多疾病。p53蛋白是一种肿瘤抑制蛋白，在许多肿瘤中存在变异[19]。p53蛋白还在其他疾病中起作用，诸如缺血性细胞损伤[20]、吸烟相关性疾病[21]。我们发现p53蛋白在气道上皮细胞生成的IGF1诱导抑制CD8+T细胞AICD过程中有作用。IGF1能够通过MEK-ERK通路诱发p53基因甲基化。其他学者证实在间质干细胞向成骨细胞转化时，IGF1同样通过MEK-ERK通路促进这一进程[22]。

总之，鼠过敏原Der p1蛋白能够诱发气道上皮细胞——RPMI2650细胞产生IGF1，后者通过诱导p53基因甲基化抑制CD8+T细胞AICD。

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网络出版时间：2015-1-9 13:37网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.012.html

Airway epithelial cell-derived insulin-like growth factor-1

triggers skewed CD8+T cell polarization

HUANG Shao-hong1, LI Yun1,QIN Jie2, AN Jun1, ZHANG Jun-hang1, RONG Jian3

(1.DeptofThoracocardiacSurgery, 2.DeptofRadiology,theThirdAffiliatedHospital,SunYet-senUniversity,Guangzhou

510630,China; 3.DeptofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospital,SunYet-senUniversity,Guangzhou510089,China)

Abstract:AimTo investigate the effects of airway epithelial cell-derived insulin-like growth factor-1(IGF1) on CD8+T cell polarization. MethodsHuman airway epithelial cell line, RPMI2650 cells, was cultured in the presence of a mice allergen, Der p1, for 72 h. IGF1 expression was checked with quantitative RT-PCR and Western blot. Der p1-primed RPMI2650 cells, recombinant IGF1 and anti-IGF1 antibody was cocultured respectively with CD8+T cells, which were activated by anti-CD3/CD8 Ab. Apoptotic cells frequency was calculated with flow cytometry. The alteration of p53 gene hypermethylation in CD8+T cells elicited by Der p1-primed airway epithelial cell and IGF1 was plotted. ResultsBoth mRNA(23.1%±5.2% vs 5.2%±2.3%，P<0.01)and protein(33.4±6.4 vs 9.2±4.6，P<0.01)expression of IGF1 in RPMI2650 cells markedly increased after exposure to Der p1. The increase of apoptotic CD3/CD28 Ab-activated CD8+T cells was abolished by the presence of Derp1-primed epithelial cells(41.7%±8.2% vs 5.2%±1.8%，P<0.01). The results were con-firmedbytheadditionofrecombinantIGF1.Anti-IGF1 antibody abolished the effect of the epithelial cells. Derp1-primed epithelial cells inhibited p53 gene mRNA(29.1%±5.9% vs 16.2%±4.3%，P<0.01)and protein(63.3±8.9 vs 26.9±5.6，P<0.01)expression. Anti-IGF1 antibody abolished the effect. Recombinant IGF1 promoted CD8+T cells′ p53 gene hypermethylation. ConclusionDer p1 induces RPMI2650 cells to produce IGF1, and this factor prevents CD8+T cell apoptosis by inducing p53 gene hypermethylation.

Key words:airway epithelial cell; insulin-like growth factor-1; p53 gene; hypermethylation; CD8+T cell; apoptosis

通讯作者荣健(1971-)，女，博士，副教授，副主任医师，研究方向：体外循环及恶性肿瘤临床与基础，，E-mail：jiji126@126.com

作者简介：黄邵洪(1976-)，男，博士，主治医师，研究方向：肺癌及食管肿瘤临床与基础，E-mail：legendhuang@126.com;

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No 81371714)；广东省自然科学基金资助项目(No S2012010008151)

收稿日期:2014-11-11,修回日期:2014-12-12

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2015)02-0204-07

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.012