HPLC-ESI-MS／MS快速测定泽兰水提物中的7种成分

HPLC-ESI-MS/MS快速测定泽兰水提物中的7种成分

强光辉，刘昆善，姚宏武，李 军

(西安市自来水有限公司，西安710082)

摘要：目的建立泽兰水提物中主要成分咖啡酸、迷迭香酸、熊果酸、芦丁、木犀草素、齐墩果酸和槲皮素快速测定的超高效液相色谱-电喷雾-三重四级杆串联质谱方法。方法超声法制备泽兰水提物，XBridge-C18(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)反相梯度洗脱法对样品进行分离；电喷雾电离源负离子模式多级反应监测扫描法对各成分进行定量分析。结果方法的相对标准偏差在0.24%～2.8%范围内，回收率在93.3%～105.2%之间，检测限为0.05～1.0 μg·L-1。结论该方法具有分析速度快，灵敏度高和特异性强的特点，可为中药中目标成分的含量测定提供方法学参考。

关键词：泽兰；高效液相色谱；质谱；电喷雾电离

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.011

中图分类号：R282文献标志码：A

收稿日期：(2015-03-20)

Simultaneous determination of seven compounds inLycopuslucidusTurcz. aqueous extract by HPLC-ESI-MS/MS

QIANG Guanghui，LIU Kunshan，YAO Hongwu，LI Jun(Xi′an Municipal Water Limited Company，Xi′an 710082，China)

Abstract:ObjectiveTo develop a method for rapid and simultaneous determination of rosmarinci acid，caffeic acid，ursolic acid，cyanidenon，phytomelin，oleanolic acid and quercetin by ultra-performance liquid chromatography-electrospray-triple quadrupole mass spectrometer. MethodsUltrasonic method was used to prepare the aqueous extract of Lycopus lucidus Turcz.；an XBridge-C18reverse phase column was employed to separate the interest compounds through gradient elution；multi reaction monitoring method under electrospray ionization and negative ion mode was utilized to determine the seven compounds. ResultsThe relative standard deviations of the method were in the range of 0.24%-2.8%；the recoveries were ranged from 93.3%-105.2%；the limits of detection were 0.05-1.0 μg·L-1. ConclusionThe proposed method has the advantages of rapid speed of analysis，high sensitivity and specificity. It is possible to become an alternative for the determination of target compounds in traditional Chinese medicine.

Key words:LycopuslucidusTurcz.；ultra-performance liquid chromatography；mass spectrometry；electrospray ionization

泽兰为唇形科植物毛业地瓜儿苗(LycopuslucidusTurcz.var.hirtus Regel)的干燥地上部分[1]，广泛分布于东北、华北、华东、中南、西南、陕西和甘肃等地。该药为中医临床广泛应用的中药之一，具有活血化瘀、行水消肿、解毒消痈的功效，在月经不调、经闭、痛经、产后瘀血、腹痛和水肿等疾病的治疗方面具有独特的疗效[2]。中华人民共和国药典收载的质量标准中仅有薄层定性鉴别，尚无定量检测方法和指标[3]，已有报道也多将研究的重点主要集中在泽兰药理药效学研究及其植物资源的可持续开发研究方面，而对其进行质量控制方面的研究较少。已有文献采用高效液相色谱法通过特征图谱和指纹图谱法研究了泽兰饮片与提取物的相关性，证明方法可用于泽兰的质量控制[4-5]。也有文献采用高效液相色谱法进行了泽兰中熊果酸、齐墩果酸和迷迭香酸的含量测定方法研究[6-7]。上述研究为泽兰及其复方质量控制提供了参考，具有潜在的推广前景。高效液相色谱-质谱联用法可将色谱的高分离能力与质谱的高灵敏结构鉴定能力结合为一体，在中药有效成分含量测定和结构鉴定方面具有独特的优势[8-11]。本研究采用超高效液相色谱(UPLC)-电喷雾(ESI)-三重四级杆串联质谱法(MS/MS)对泽兰水提物中迷迭香酸等7种成分进行了测定，旨在建立泽兰高灵敏和高特异的快速含量测定方法，为泽兰质量标准的建立提供方法学参考。

1仪器与试药

1.1仪器美国Waters公司ACQITY UPLC TM系统，包括：二极管阵列检测器，二元高压梯度泵，API 3200 OV，AP串联三重四极杆线性离子阱质谱仪(美国AB公司)；超声波仪(上海易净超声波仪器有限公司)。

1.2试药泽兰药材购自陕西省中药材公司，由西安市食品药品检验所鉴定为LycopuslucidusTurcz.的干燥地上部分；迷迭香酸对照品(批号 100526)、咖啡酸对照品(批号 110885-00102)、熊果酸对照品(批号 110742-200517)、木犀草素对照品(批号 111520-200809)、芦丁对照品(批号 080-9303)、齐墩果酸对照品(批号 110709-200505)和槲皮素对照品(批号 100081-200406),均购自中国药品生物制品检定所；色谱纯甲醇(美国Fisher公司)；自制超纯水；其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1样品制备

2.1.1对照品溶液的制备分别准确称取迷迭香酸、咖啡酸、熊果酸、木犀草素、芦丁、齐墩果酸和槲皮素对照品2.0，1.5，3.0，4.0，1.5，2.0和3.5 mg，置于5.0 mL量瓶中，用甲醇溶解加甲醇定容至刻度，制备质量浓度分别为0.4，0.3，0.6，0.8，0.3，0.4和0.7 mg·mL-1的对照品储备溶液，4.0 ℃冷藏备用。

2.1.2泽兰供试品溶液的制备 取适量泽兰药材，50 ℃条件下干燥至恒质量，粉碎后过40目筛。准确称取药材粉末10.0 g，加水300 mL，超声提取30 min(频率为60 Hz)。滤过，重复提取2次，收集2次滤液，减压蒸干，以水为溶剂定容于5.0 mL量瓶中，0.45 μm水系微孔滤膜滤过。

2.2分析条件

2.2.1色谱条件XBridge-C18(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)色谱柱；流动相A液为甲醇，B液为含5×10-3mol·L-1甲酸胺水溶液；0 min，25% A；7 min，80% A；7.01～9.0 min，25% A；流速为0.4 mL·min-1；检测波长为280 nm；柱温设定为40 ℃；进样体积为2.0 μL。

2.2.2质谱条件电喷雾电离源负离子模式电离；喷雾电压设定为-4 500 V；离子源温度设定为550 ℃；离子源辅助气压力为1 369 kPa。

3结果与讨论

3.1方法的优化

3.1.1色谱条件的优化色谱流动相组成是电喷雾源中待测样品离子化效率高低的关键影响因素。本研究分别以乙腈或甲醇为流动相A；2.0，5.0和10.0 mmol·L-1甲酸胺水混合溶液作为流动相B。改变梯度洗脱条件，测试混合对照品溶液中各物质的分离效果及离子化效率。结果表明：拟定梯度洗脱条件下，各待测指标的分离度最好；甲酸胺浓度对待测指标的分离度无显著影响，但可影响其离子化效率。当甲酸胺浓度为2.0 mmol·L-1时，混合对照样品总离子流图中各待测指标离子强度明显偏低，仅为105；当甲酸胺浓度为5.0和10.0 mmol·L-1时，各对照品的离子化效率明显增加，离子强度达107；但当流动相中添加10.0 mmol·L-1甲酸胺时，基线噪音明显增大，约为5.0 mmol·L-1甲酸的3倍。乙腈水体系与甲醇水体系相比，对色谱峰的分离度和离子化效率无显著影响。从毒性和经济角度考虑，本研究选择甲醇为A液，含5.0 mmol·L-1甲酸胺水溶液为B液；最佳梯度条件为0 min，25% A；7 min，80% A；7.01～9.0 min，25% A。

3.1.2MS/MS条件的优化采用蠕动泵连续注射各对照样品溶液的方法手动优化多级反应监测扫描(MRM)定量模式的最佳条件。各对照品母离子的质荷比通过Q1全扫描确定，子离子通过碎片离子扫描确定，通过强度最大的母离子和子离子确定选择反应离子对。用该离子对优化碰撞入口电压(CEP)、碰撞出口电压(CXP)、解簇电压(DP)、入口电压(EP)和碰撞能量(CE)等参数，以选择离子对的离子信号具有较高的稳定性和灵敏度。选择灵敏度最高的离子对进行定量测定，得到最佳质谱检测条件，见表l。

表17种对照品电喷雾质谱检测最佳条件

Tab.1 The optimized parameters for the determination of the seven standards by electrospray tandem mass spectrometry

名称母离子子离子DP/VEP/VCEP/VCE/VCXP/V迷迭香酸359.2197.1359.2160.9a-24-6-11-12-4咖啡酸179.2135.0a-20-4-13-14-3熊果酸455.7425.4a-25-2-16-20-8木犀草素285.2133.0a-25-2-12-10-4芦丁609.5300.2a-36-6-25-25-3齐墩果酸455.8409.6a-32-2-17-18-4槲皮素 301.2283.1301.2273.2a-20-8-45-26-2

a：定量离子对

3.2工作曲线、检测限和定量限分别取各对照品储备溶液适量，混合均匀，加甲醇配制成质量浓度依次为5，10，25，50，100，250，500，1 000，2 500，5 000和10 000 μg·L-1的混合对照品溶液。进样分析，测定各对照品提取离子峰的峰面积，并与质量浓度(μg·L-1)进行回归，结果见表2。检测限按信噪比等于3计算，定量限按信噪比等于10计算，见表2。由表2可知，迷迭香酸等对照品在5～10 000 μg·L-1质量浓度范围内，提取离子峰峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，检测限为0.05～1.0 μg·L-1，定量限为0.2～3.0 μg·L-1。

表27种对照品线性关系、检测限和定量限

Tab.2 Calibration curve，limits of detection and limits of quantificationfor the seven standards

成分回归方程r线性范围/μg·L-1检测限/μg·L-1定量限/μg·L-1迷迭香酸Y=412X+93000.99655～50000.050.2咖啡酸Y=326X+124350.998410～25000.100.3熊果酸Y=335X+112700.99015～100000.200.5木犀草素Y=216X+86470.994610～100000.050.2芦丁Y=552X+103260.99875～50000.401.2齐墩果酸Y=496X+76900.99515～25000.501.5槲皮素Y=208X+71490.99895～50001.003.0

3.3方法的精密度和回收率分别称取24份泽兰干燥粉末，6份不加对照品溶液，6份分别加入质量浓度为10 μg·L-1的混合对照品溶液1.0 mL，6份分别加入100 μg·L-1的混合标准溶液1.0 mL，其余6份加入质量浓度为2 500 μg·L-1的混合对照品溶液1.0 mL，按照药材提取方法进行提取，定容于100 mL量瓶中。拟定分析条件下进行分析。结果发现，3个标准添加质量浓度迷迭香酸等物质的测定回收率在93.3%～104.7%，95.2%～101.4%，98.1%～104.6%，96.7%～102.5%，99.0%～104.8%，97.8%～105.2%和97.6%～101.7%之间，相对标准偏差在0.24%～2.3%，0.36%～2.8%，0.68%～2.0%，1.0%～2.4%，0.35%～1.2%，0.82%～2.8%和0.74%～2.7%范围内，表明该方法回收率满足药材中指标成分的含量测定要求，且精密度良好。

3.4含量测定按照2.1.2项下方法，分别制备6份泽兰药材溶液，精密吸取2.0 μL，拟定条件下进样分析。图l泽兰提取液中各待测指标MRM模式的萃取离子对色谱图。由图1可见，7种待测指标均有较高灵敏度，且可在5.0 min之内完成分离和检测。泽兰药材中迷迭香酸、咖啡酸、熊果酸、木犀草素、芦丁、齐墩果酸和槲皮素的含量分别为1.27，0.25，0.36，0.12，0.26，1.42和0.42 mg·g-1。

图1泽兰药材多级反应模式的提取离子流图

Fig.1 Extracted ion chromatograms ofLycopuslucidusTurcz. aqueous extract in multi reaction monitoring acquisition mode

m/z：(a)179.2>135.0；(b)359.2>160.9；(c)285.2>133.0；(d)455.7>425.4；(e)455.8>409.6；(f)609.5>300.2；(g)301.2>273.2

3小结

本文采用超声萃取制备泽兰总提物，超高效液相色谱进行分离、离子阱多级反应模式进行检测的方法，对泽兰水提物中酚酸类和黄酮类化合物进行了检测分析。结果发现，与经典的液相色谱法相比，该方法特异性强，其他共存物质无干扰。此外，由于使用了选择离子对检测技术，该方法对含量较低的咖啡酸、木犀草素和芦丁依然具有高灵敏度，且测试结果准确。该方法操作简单，分析时间短，有望为泽兰质量控制方法的建立提供方法学借鉴。

参考文献：

[1]刘君.泽兰的化学成分及药理研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2008，10(1)：23-24.

[2]周迎春，郭丽新，王世龙.泽兰有效成分对急性血瘀大鼠凝血功能和体外血栓形成的影响[J].中医药学报，2013，41(1):22-24.

[3]国家药典委员会.中国药典2010年版[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010.

[4]陈慕媛，黄月纯，刘东辉，等.泽兰饮片及不同部位HPLC指纹图谱研究[J].中成药，2010，32(12):2029-2032.

[5]黄月纯，张子龙，魏刚，等.泽兰及其精制提取物HPLC特征图谱的相关性研究[J]. 药物分析杂志， 2011，31(8):1506-1510.

[6]杨学猛，徐风梅.HPLC法测定泽兰中熊果酸、齐墩果酸的含量[J].中草药，2003，34(10)：11，31.

[7]童欣，贺凡珍，彭维，等. HPLC 法同时测定泽兰中咖啡酸和迷迭香酸的含量[J].中草药，2012，35(2):246-247.

[8]冯建明，陈卓，梁建强，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定野生蘑菇中2类肽类毒素的含量[J].西北药学杂志，2013，28(4):351-354.

[9]李倩，廖予菲，杨洋，等.HPLC-ESI-TOF-MS法优选麻黄中麻黄碱的提取工艺 [J].西北药学杂志，2013，28(1):4-7.

[10]孙连娜，陈万生，陶朝阳，等.泽兰化学成分的研究[J].第二军医大学学报，2004，25(9):1029-1030.

[11]孙连娜，陈万生，陶朝阳，等.泽兰化学成分的研究[J].解放军药学学报，2004，20(3):172-173.