喜马拉雅红豆杉与曼地亚红豆杉中紫杉醇和三尖杉宁碱含量比较

喜马拉雅红豆杉与曼地亚红豆杉中紫杉醇和三尖杉宁碱含量比较

徐晓琴，魏鸿雁*，贾晓光，夏提古丽·阿不利孜，马晓玲，陈刚

(新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，乌鲁木齐830002)

摘要：目的测定并比较维吾尔药材喜马拉雅红豆杉与人工栽培品种曼地亚红豆杉中紫杉醇和三尖杉宁碱的含量。方法采用RP-HPLC色谱法梯度洗脱，色谱柱为Century SIL C18-EPS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为227 nm；柱温为30 ℃。结果紫杉醇回归方程：Y=2.050 975×107X+5 531.887，线性范围为0.042～1.69 μg(r=0.999 9) ，平均回收率为98.0%，RSD=0.98%(n=6)；三尖杉宁碱回归方程Y=1.806 535×107X+3 046.378，线性范围为0.040～1.6 μg(r=0.999 9)，平均回收率为96.6%，RSD=2.97%(n=6)，喜马拉雅红豆杉叶中三尖杉宁碱平均含量高于茎中含量，曼地亚红豆杉相反；两者叶中紫杉醇含量高于茎中含量，而曼地亚红豆杉茎叶中紫杉醇含量并不低于喜马拉雅红豆杉。结论该方法简便、准确、适用于红豆杉药材的质量评价。

关键词：喜马拉雅红豆杉；曼地亚红豆杉；紫杉醇；三尖杉宁碱

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.007

中图分类号：R284文献标志码：A

作者简介：徐晓琴，女，助理研究员，硕士

收稿日期：(2015-03-09)

The contents comparison of taxol and cephalomannine betweenTaxuswallichianaZucc. andTaxusmeadia

XU Xiaoqin，WEI Hongyan*， JIA Xiaoguang， Xiat Tiguli ABULIZI，MA Xiaoling,CHEN Gang(Xinjiang Institute of Chinese Traditional Medicine and Ethical Materia Medicine，Urumqi 830002，China)

Abstract:ObjectiveTo determine and compare the contents of taxol and cephalomannine between Taxus wallichiana Zucc.and Taxus meadia by RP-HPLC.Methods The isolation was performed on a Century SIL C18-EPS column (250 mm×4.6 mm，5 μm)， with the mobile phase consisting of acetonitrile-water，the flow rate of 1.0 mL·min-1，detection wavelength of 227 nm. The column temperature was 30 ℃.Results The regression equation of taxol was Y=2.050 975×107X+5 531.887， linear range within 0.042-1.69 μg(r=0.999 9). The average recovery was 98.0%，RSD =0.98%(n=6);the regression equation of cephalomannine was Y=1.806 535×107X+3 046.378 ，linear range within 0.040-1.6 μg(r=0.999 9).The average recovery was 96.6%，RSD=2.97%(n=6).The cephalomannine content in leaves of Taxus wallichiana Zucc was higher than the average content of stem，Taxus meadia； The taxol content in leaves was higher than the content in stem， and the taxol content in Taxus meadia leaf was not lower than that in Taxus wallichiana Zucc. Conclusion The chromatography method is simple， accurate， and it is suitable for the quality evaluation of Taxus.

Key words:TaxuswallichianaZucc.；Taxusmeadia；taxol；cephalomannine

*通信作者：魏鸿雁，女，研究员，硕士

红豆杉是红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)植物的总称，是中国一级珍稀濒危保护植物。红豆杉科共有5属23种植物[1]，目前我国共有4个种和1个变种，即(T.wallichiana)、 (Taxuswallichi-ann)、 (T.cuspida-ta)、(T.chinensis(Pilger)Rehd.)和 (T.chinensisvar.Mairei)(变种)。曼地亚红豆杉(T.media)是我国20世纪90年代中期从加拿大引种而来，是我国引种栽培的最广泛的品种，据文献报道，目前除西藏红豆杉外其余国产品种均有人工种植记录[2-3]。

西藏红豆杉为维吾尔医临床习用药材，又名喜马拉雅红豆杉Taxuswallichiana.Zucc.， 药用部位为干燥枝及叶，在维吾尔药安胃加瓦日西吾地吐如西片、消食阿米勒努西颗粒等成方制剂中作为原料药材使用，主要用于消化道疾病和神经衰弱等症[4-6]。目前由于野生喜马拉雅红豆杉生长缓慢，资源有限，且属于濒危品种，其药材来源限制了维吾尔医药的发展，而人工种植的曼地亚红豆杉目前主要作为观赏植物，尚未见作为药用品种的报道。

因此，课题组采用RP-HPLC色谱法对喜马拉雅红豆杉与曼地亚红豆杉植物的茎、叶中活性成分紫杉醇与三尖杉宁碱的含量进行比较，以期为红豆杉药材的质量评价提供参考，同时为维药材喜马拉雅红豆杉代用品的科学选择提供依据。

1仪器与试药

1.1仪器Metter AE163电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；电热鼓风干燥箱烘箱(上海安亭科学仪器有限公司)；LC-2010CHT型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；UPT-1-5超纯水仪(成都优普超纯科技有限公司)；KQ5200DA超声仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药红豆杉药材8批，均为市售，由新疆中药民族药研究所副研究员王果平鉴定为真品；紫杉醇(C47H51NO14，中国食品药品检定研究所，批号100382-201102)；三尖杉宁碱(中国食品药品检定研究所，批号100926-201102)；甲醇、乙腈均为色谱纯；水为超纯水。

2方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性[7-9]色谱柱：大连江申Century SIL C18-EPS柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；检测波长为227 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。流动相乙腈(A)-水(B)梯度洗脱，A相随时间变化：40%(0～30 min)，80%(30～55 min)，40%(55～65 min)，40%(65～75 min)。在此色谱条件下，三尖杉宁碱的保留时间为40.7 min，紫杉醇的保留时间为43.4 min，理论板数均大于8 000，分离度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之间。

2.2溶液配制对照品溶液的制备:取干燥至恒质量的三尖杉宁碱和紫杉醇对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成1 mL含80.80 μg的三尖杉宁碱溶液和1 mL含84.88 μg的紫杉醇溶液。

供试品溶液的制备:取红豆杉药材粗粉2.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇20 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率25 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.3专属性考察分别取三尖杉宁碱、紫杉醇对照品溶液和供试品溶液各10 μL进行测定，按相应色谱条件测定，结果见图1。

2.4线性关系考察分别精密吸取上述对照品储备液0.5，5，10，15和20 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积积分值对质量浓度(mg·mL-1)进行回归，得紫杉醇和三尖杉宁碱回归方程分别为：Y=2.050 975×107X+5 531.887；Y=1.806 535×107X+3 046.378，结果表明，紫杉醇和三尖杉宁碱的进样量分别在0.042～1.69 μg(r=0.999 9)和0.040～1.6 μg(r=0.999 9)范围内呈良好的线性关系。

图1HPLC图

A.混合对照品图；B.供试品图；1.三尖杉宁碱对照品；2.紫杉醇对照品

Fig.1 HPLC charomatograms

A.mixed reference substances；B.sample；1.cephalomannine；2. taxol

2.5精密度实验精密吸取对照品溶液，连续进样5次，每次10 μL，测定峰面积积分值计算RSD值。结果三尖杉宁碱峰面积的RSD为0.52%(n=5)，紫杉醇峰面积的RSD为0.44%(n=5)，说明仪器和色谱条件均具有良好的精密度。

2.6稳定性取同一批红豆杉药材制成供试品溶液，分别于0，2，4，6，8和10 h进样10 μL，测得三尖杉宁碱的含量依次为0.94，0.94，0.89，0.87，0.84和0.82 mg·g-1，平均值为0.886 mg·g-1，RSD为5.07%；紫杉醇的含量依次为1.00，0.96，0.95，0.95，0.91和0.88 mg·g-1，平均值为0.945 mg·g-1，RSD为4.45%。

2.7重复性实验精密称取同一批样品5份(每份2.0 g)，按供试品溶液制备项下方法制备溶液及上述色谱条件测定，结果三尖杉宁碱的平均含量为0.917 mg·g-1，RSD为3.0%，紫杉醇的平均含量为0.988 mg·g-1，RSD为1.89%。测定结果表明此方法重复性良好。

2.8回收率实验精密称取供试品2.0 g，共6份，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，按2.2项下供试品制备方法制备溶液，分别精密吸取供试品溶液2 mL、对照品溶液2 mL，混匀，过滤取续滤液在含量测定色谱条件下进样10 μL，计算回收率、结果、样品中三尖杉宁碱的平均回收率为96.6%(n=6)，RSD=2.97%。紫杉醇平均回收率为98.0%(n=6)，RSD=0.98%。见表1。

2.9样品测定取不同批次红豆杉药材按2.2方法制备供试品溶液，按2.1色谱条件进样测定，记录色谱峰面积积分值，分别计算三尖杉宁碱和紫杉醇的含量，结果见表2。

表1回收率测定结果

Tab. 1 Results of recovery test

( n=6)

表2样品含量测定结果

Tab.2 Results of the samples content determination

( n=8)

3讨论

红豆杉植物中含有多种紫杉烷类化合物，而这类化合物极性相近，笔者预实验中采用甲醇-水、乙腈-水等度洗脱，但分离效果不理想，随后又采用经典的VLC法对红豆杉药材氯仿和甲醇提取物中的紫杉烷类化合物进行有效富集，并对其进行定性定量分析。结果显示，经过硅胶吸附再洗脱，馏分中紫杉醇相对含量有所提高，但是这一结果并不能真实体现药材中紫杉醇的含量。因此，笔者通过简化前期处理步骤，最大限度减少紫杉醇的损失，色谱洗脱方法进而改用梯度洗脱法，从而增大主峰与杂质峰的分离度，改善分离效果，实验结果显示，所采用的RP-HPLC色谱条件适用于红豆杉科植物中紫杉醇化合物的含量分析，并能够为红豆杉科植物的质量控制提供参考。

稳定性实验测定结果表明，在考察的10 h范围内，样品随时间变化其所含三尖杉宁碱和紫杉醇的相对含量呈逐渐下降趋势，所以制备的样品溶液最好临用新配。

野生品种喜马拉雅红豆杉与人工种植品种曼地亚红豆杉进行比较，由结果可知喜马拉雅红豆杉叶中三尖杉宁碱的平均含量高于茎中的含量，而人工种植的曼地亚红豆杉叶中三尖杉宁碱结果与其相反；人工种植的曼地亚红豆杉茎、叶中紫杉醇含量并不低于野生品种，笔者分析这可能与药材的生长年限、生长环境及药材活性成分在植物体不同药用部位的累积规律和采集时间有很大关系，为有效评价曼地亚红豆杉的质量及科学寻找野生喜马拉雅红豆杉的代用品还有待进一步的研究。

参考文献：

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