过表达BMP9对人肺鳞状细胞癌细胞NCI-H520迁移和侵袭的影响

过表达BMP9对人肺鳞状细胞癌细胞NCI-H520迁移和侵袭的影响*

王静，邓芳，李亚，范梦恬，郭杨柳，施琼△

(重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室，重庆 400016)

[摘要]目的： 探讨骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9，BMP9)对人肺鳞状细胞癌细胞NCI-H520迁移和侵袭的影响及其机制。方法: 采用RT-PCR和Western blot法分别检测NCI-H520细胞和正常人支气管上皮(HBE)细胞中BMP9的mRNA和蛋白表达水平；用AdBMP9感染NCI-H520细胞，RT-PCR和Western blot法验证BMP9的变化；应用划痕愈合实验检测各组细胞的迁移能力， Transwell小室检测迁移和侵袭能力，并用RT-PCR和Western blot法检测迁移相关因子基质金属蛋白酶2 (MMP2) 的mRNA和蛋白水平。Western blot法检测BMP-Smad 经典通路中Smad1/5的磷酸化水平(p-Smad1/5)。用BMP特异性拮抗剂AdNoggin与AdBMP9共处理NCI-H520细胞，检测p-Smad1/5及细胞迁移能力的变化。结果: BMP9在NCI-H520细胞中的mRNA和蛋白水平均比在HBE细胞中低；AdBMP9感染的NCI-H520细胞中 BMP9的mRNA和蛋白水平均明显升高，细胞迁移和侵袭能力均明显下降，MMP2的mRNA和蛋白水平下降，且p-Smad1/5的表达水平明显上调。在NCI-H520细胞中，Noggin能有效逆转BMP9导致的p-Smad1/5升高和细胞迁移抑制能力。 结论: 外源性BMP9转入肺鳞癌细胞NCI-H520可明显抑制其迁移侵袭的能力，该抑制作用可能与BMP-Smad信号通路的激活有关。

[关键词]骨形态发生蛋白9； 肺鳞状细胞癌； 细胞迁移； 细胞侵袭

[中图分类号]R735.7; R730.23 [文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.001

[文章编号]1000-4718(2015)11-1928-05

[收稿日期]2015-08-07[修回日期] 2015-10-12

[基金项目]*国家自然科学基金资助项目(No. 81170514; No. 81470318)

通讯作者△Tel： 0531-82169867； E-mail： yuyuandoctor@163.com

Effect of BMP9 over-expression on migration and invasion of human lung squamous-cell carcinoma NCI-H520 cellsWANG Jing, DENG Fang, LI Ya, FAN Meng-tian, GUO Yang-liu, SHI Qiong

(KeyLaboratoryofClinicalLaboratoryDiagnostics,MinistryofEducation,CollegeofLaboratoryMe-dicine,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:anniesq8718@aliyun.com)

ABSTRACT[]AIM: To investigate the effect of bone morphogenetic proteins 9 (BMP9) on the migration and invasion abilities of human lung squamous-cell carcinoma NCI-H520 cells and its mechanism. METHODS: The expression of BMP9 at mRNA and protein levels in the NCI-H520 cells and human bronchial epithelial (HBE) cells was detected by RT-PCR and Western blot. The NCI-H520 cells were transfected with the recombinant adenovirus AdBMP9 and the expression of BMP9 at mRNA and protein levels was validated by RT-PCR and Western blot. The migration and invasion abilities of the NCI-H520 cells were determined by wound-healing and Transwell assays. The mRNA and protein levels of the migration-related factor matrix metalloproteinase 2 (MMP2) were detected by RT-PCR and Western blot. The level of phosphorylated Smad1/5 (p-Smad1/5) was detected by Western blot. Meanwhile, NCI-H520 cells were treated with BMP specific antagonist AdNoggin and AdBMP9. The level of p-Smad1/5 and the cell migration ability were measured by Western blot, wound-healing and Transwell assays. RESULTS: The expression of BMP9 at mRNA and protein levels was lower in NCI-H520 cells than that in HBE cells. After AdBMP9 was stably transfected into the NCI-H520 cells, the expression of BMP9 at mRNA and protein levels was significantly up-regulated, cell migration and invasion abilities were significantly decreased, and the mRNA and protein levels of MMP2 were decreased. Meanwhile, the level of p-Smad1/5 was increased. Noggin reversed BMP9-caused the increase in p-Smad1/5 and the decrease in cell migration ability. CONCLUSION: Over-expression of BMP9 inhibits the migration and invasion abilities of lung squamous-cell carcinoma NCI-H520 cells. The activation of BMP-Smad signaling pathway may be involved in this inhibitory process.

[KEY WORDS]Bone morphogenetic protein 9; Lung squamous-cell carcinoma;cell migration; Cell invasion

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，每年新增的肺癌患者已超过 120 万人,是恶性肿瘤引起死亡的首要原因[1]。非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞肺癌，约占肺癌总数的 85%左右[2]。据统计，肺鳞癌近十年的发病率成倍增长，特别是在大中城市[3]。而侵袭和转移是造成非小细胞肺癌患者疗效差和死亡的主要原因[4]。因此，探讨非小细胞肺癌侵袭、转移的分子生物学机制可望为其临床治疗提供新的策略。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是转化生长因子β超家族中的一员，对胚胎发育及维持体内组织器官的平衡等具有重要的生物学作用[5]。BMP主要通过与I型、Ⅱ型受体结合，激活Smad1/5/8使其磷酸化水平升高，与Smad4结合后入核激活下游的转录因子；拮抗剂Noggin可与BMP特异性结合，阻止BMP与细胞表面受体结合从而抑制BMP发挥生物学效应[6]。近年来，有关BMP信号通路与肿瘤发生的研究报道逐渐增多，尤以BMP2、3、4、5、6、7最为常见[7]。BMP9是BMPs家族中发现较晚、研究较少的一员，在不同类型的肿瘤中发挥不同的效应[8-9]，而目前BMP9在肺癌中的作用及作用机制还鲜有报道。

本研究选择重组腺病毒AdBMP9感染的方式过表达BMP9，检测BMP9对肺鳞癌细胞NCI-H520迁移和侵袭的影响，并对其分子生物学机制进行探讨，旨在为肺癌的治疗提供新的实验依据。

材料和方法

1细胞株及腺病毒

人肺鳞癌细胞株NCI-H520购自ATCC；人胚肾细胞株HEK293及重组腺病毒AdGFP、AdRFP、AdBMP9、AdNoggin均由本实验室保存备用。

2主要试剂

DMEM高糖培养基、RPMI-1640培养基和胎牛血清均购自Gibco；TRIzol购自Invitrogen；逆转录试剂盒购自TaKaRa；RT-PCR引物由上海百力格公司合成；Transwell小室购自Corning；结晶紫购自上海碧云天生物技术有限公司；凝聚胺(polybrene)、MTT和基质胶均购自Sigma；抗BMP9抗体购Abcam；抗MMP2抗体购自沈阳万类生物；抗Smad1/5/8抗体购自Santa Cruz；抗p-Smad1/5抗体购自CST；抗β-actin抗体、羊抗兔IgG/辣根过氧化物酶标记的 II 抗和羊抗鼠IgG/辣根过氧化物酶标记的 II 抗均购自北京中杉金桥公司。

3实验方法

3.1细胞培养和病毒感染将AdGFP、AdRFP、AdBMP9和AdNoggin分别接种于HEK293细胞，用含10% 胎牛血清的DMEM(含100 U/L青霉素和100 mg/L 链霉素)扩增培养。用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基(含1×105U/L 青霉素和100 mg/L 链霉素)培养NCI-H520细胞，将扩增的腺病毒感染NCI-H520细胞，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养，以不感染病毒的细胞作为空白对照。

3.2划痕愈合实验检测细胞迁移能力NCI-H520细胞以5×105/well接种于6孔板中，待细胞愈合率达80%时，加入polybrene和重组腺病毒，6 h后用10 μL小枪头行“一”字划痕，PBS清洗3次，加入无血清的RPMI-1640培养基，倒置显微镜下观察并照相，此时记为0 h，37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养48 h后在同一观察点观察划痕愈合情况并照相，通过测量多个区域的划痕宽度取平均值，计算各组细胞的划痕愈合率。划痕愈合率(%)=(0 h划痕宽度-48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。实验重复3次。

3.3Tanswell小室检测细胞迁移和侵袭能力将腺病毒感染48 h的各组NCI-H520细胞制成无血清的单细胞悬液，将含有8×104细胞的400 μL悬液加入上室(侵袭实验需铺基质胶，基质胶与RPMI-1640培养基按1∶7比例，铺50 μL)，下室中加入700 μL含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基，每组设3个复孔。37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，取出小室，用棉签拭去小室孔膜上层细胞，4%多聚甲醛固定小室20 min，结晶紫染色30 min，干燥后于显微镜下计数，每个小室至少计数10个视野，计算平均值，实验重复3次。

3.4RT-PCR法检测细胞中相关因子的mRNA表达取重组腺病毒感染48 h及未感染病毒的细胞，TRIzol法提取各组细胞总RNA，两步法逆转录，以逆转后的cDNA进行PCR扩增，PCR反应体系为20 μL，引物序列及产物长度见表1。反应条件为：94 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，34个循环；72 ℃ 30 s。采用Quantity One软件对结果进行灰度值分析，并以目的条带与内参照条带的灰度值之比，计算BMP9、MMP2和Noggin的相对表达水平，实验重复3次。

表1　RT-PCR引物序列

3.5Western blot检测BMP9、MMP2及BMP-Smad信号通路关键分子的蛋白水平收集病毒感染48 h的NCI-H520细胞，提取总蛋白，与5×蛋白上样缓冲液混合，沸水煮10 min，BCA法检测蛋白浓度，取50 μg蛋白样品，经SDS-PAGE分离蛋白、转膜、BSA封闭、4 ℃孵育 I 抗(稀释比例为：BMP9 1∶500，Smad1/5/8 1∶1 000，p-Smad1/5 1∶1 000，β-actin 1∶1 000)过夜，洗膜，37 ℃孵育 II 抗(稀释比例为1∶5 000)1 h，洗膜，化学发光显影，采用Quantity One软件对各组电泳条带进行灰度值分析，并与内参照β-actin相比，计算各蛋白相对表达水平，实验重复3次。

4统计学处理

采用SPSS 17.0软件对各实验结果进行统计学分析，各实验均重复3次；数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用t检验比较两组间差异，两组以上比较采用单因素方差分析，并用Bonferroni校正的t检验进行组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1BMP9在肺鳞癌细胞NCI-H520中的表达低于正常支气管上皮细胞HBE

RT-PCR检测结果显示，肺鳞癌细胞NCI-H520中BMP9的mRNA表达水平较正常支气管上皮细胞HBE低(P<0.05)，Western blot结果显示，NCI-H520细胞中BMP9的蛋白表达水平较HBE明显降低(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The expression of BMP9 at mRNA and protein levels in the HBE cells and NCI-H520 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHBE group.

图1HBE细胞和NCI-H520细胞中BMP9的mRNA和蛋白表达水平

2重组腺病毒AdBMP9能有效上调NCI-H520细胞中BMP9的表达

分别将重组腺病毒AdGFP和AdBMP9感染NCI-H520细胞，48 h后感染效率达80%以上。RT-PCR和Western blot结果显示，NCI-H520感染AdBMP9后，BMP9表达水平较阴性对照组明显上调(P<0.01)，由此证实BMP9在NCI-H520中成功高表达，见图2。

Figure 2.The infection efficiency of recombinant adenovirus AdBMP9 in the NCI-H520 cells, and the mRNA and protein levels of BMP9 in the NCI-H520 cells detected after over-expression of BMP9. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsGFP group.

图2AdBMP9感染NCI-H520细胞的感染效率及过表达BMP9后NCI-H520细胞中BMP9的mRNA和蛋白表达水平

3NCI-H520细胞中过表达BMP9可抑制细胞的迁移和侵袭，且MMP2的mRNA和蛋白水平均降低

划痕愈合实验显示，空白组48 h的划痕愈合率(64.08±4.45)%，与阴性对照组[(59.01±3.36)%]比较，差异无统计学意义，而感染AdBMP9组的划痕愈合率[(25.43±2.30)%]与阴性对照组相比明显降低(P<0.01)。Transwell迁移实验显示，感染AdBMP9组中NCI-H520细胞穿过小室膜的细胞数显著少于空白组和阴性对照组(P<0.01)。Transwell侵袭实验显示，感染AdBMP9组中穿过基质胶的NCI-H520细胞数显著少于空白组和阴性对照组(P<0.01)。RT-PCR和Western blot结果显示，感染AdBMP9组中MMP2表达水平较阴性对照组明显降低(P<0.05)，见图3。

Figure 3.The effects of BMP9 on the migration and invasion abilities of the NCI-H520 cells. The mRNA and protein levels of MMP2 in the NCI-H520 cells were detected after over-expression of BMP9. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsGFP group.

图3BMP9对NCI-H520细胞迁移侵袭的影响及MMP2 mRNA和蛋白水平的变化

4过表达BMP9后，NCI-H520细胞中BMP-Smad经典通路被激活，p-Smad1/5水平明显升高

Western blot结果显示，NCI-H520细胞过表达BMP9后，p-Smad1/5水平与空白组和阴性对照组相比明显升高(P<0.01)，说明BMP9有效激活了NCI-H520中BMP-Smad经典通路，见图4。

Figure 4.The level of p-Smad1/5 in the NCI-H520 cells after over-expression of BMP9. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsGFP group.

图4Western blot检测过表达BMP9后，NCI-H520细胞中p-Smad1/5的表达水平

5BMP拮抗剂Noggin能有效逆转BMP9导致的p-Smad1/5升高和细胞迁移抑制能力

用BMP特异性拮抗剂Noggin的腺病毒(AdNoggin)与AdBMP9共同感染NCI-H520细胞48 h后，AdNoggin感染细胞效率达80%以上；RT-PCR结果显示，加AdNoggin组中Noggin的表达水平明显升高，证实Noggin在细胞中成功高表达。Western blot结果显示，AdNoggin与AdBMP9共感染组中p-Smad1/5表达水平比对照组明显降低，说明AdNoggin对BMP-Smad通路的拮抗作用是有效的。同时，用AdNoggin处理NCI-H520细胞后检测细胞的迁移能力，划痕愈合实验和Transwell迁移实验结果显示，Noggin能有效逆转BMP9对NCI-H520细胞的迁移抑制能力(P<0.01)，见图5。

讨论

肺癌作为一种最常见的原发性恶性肿瘤，其发生是一个多基因参与、多步骤、 多阶段的过程，目前对寻找治疗肺癌的新靶点仍十分迫切。刘丽等[10]应用基因芯片筛出早期肺鳞癌的发生与多个基因的表达变化有关。随着人们对肿瘤研究的深入，发现BMPs在很多类型肿瘤的发生发展中具有重要作用。Jiang等[11]和Fei等[12]在鼠肺癌模型中发现，BMP2合成增加会增加肿瘤发生率并影响预后。BMP2在人非小细胞肺癌组织中有高表达，并能刺激肺腺癌细胞A549的体外生长和侵袭[13]。此外，BMP3B在肺癌中的表达水平较正常肺细胞株明显降低；BMP6的蛋白表达水平在非小细胞肺癌中较正常组织有轻微的增高[14]。BMP9作为BMPs一员，在不同肿瘤中的作用不尽相同，在肝癌、卵巢癌中BMP9可促进肿瘤细胞的增殖[8, 15]；在前列腺癌、乳腺癌、胃癌中却有抑制肿瘤生长、转移、侵袭的作用[9, 16-17]。Ye等[9]发现BMP9在前列腺癌组织及细胞中低表达，过表达BMP9可抑制前列腺癌 PC3 细胞的生长、侵袭、转移。在乳腺癌中，BMP9可抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移，其作用与ERK1/2和PI3K/AKT信号通路有关[15]。然而，BMP9在肺癌中的作用及作用机制尚缺乏研究，鲜有报道。

本研究发现，BMP9在肺鳞癌细胞NCI-H520中的表达明显低于正常支气管上皮细胞HBE。本研究采用重组腺病毒AdBMP9感染NCI-H520细胞，使其过表达BMP9后，检测到过表达BMP9的肺鳞癌细胞NCI-H520的迁移和侵袭能力显著降低。BMP-Smad信号通路作为BMPs发挥生物学作用的经典信号通路。在过表达BMP9的NCI-H520细胞中，我们发现BMP-Smad经典通路中Smad1/5的磷酸化水平明显增高。另外，用BMP特异性拮抗剂Noggin的重组腺病毒AdNoggin联合AdBMP9处理NCI-H520细胞后，p-Smad1/5表达水平有所下降，且细胞划痕愈合率及Transwell小室迁移率也有显著的降低。以上结

Figure 5.The infection efficiency of AdRFP and AdNoggin in the NCI-H520 cells, the expression of Noggin mRNA, BMP9 mRNA and p-Smad1/5 protein in the NCI-H520 cells， and the migration ability of NCI-H520 cells after treated with BMP specific antagonist AdNoggin and AdBMP9. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsGFP group and RFP+BMP9 group.

图5BMP特异性拮抗剂Noggin处理细胞后，Noggin、BMP9的mRNA表达水平和p-Smad1/5的变化，以及细胞迁移能力的变化。

果说明BMP9可能通过经典的BMP-Smad信号通路调节肺癌的生长与转移等生物学活性。

综上所述，过表达BMP9能够显著抑制肺鳞癌细胞NCI-H520的迁移和侵袭，其机制可能与激活BMP-Smad经典信号通路有关，由此BMP9可能成为肺癌治疗的一个新靶点。由于BMP激活的通路还包括非经典通路如p38 MAPK、ERK、PI3K-AKT等信号通路，BMP9是否还可通过非经典通路，或还有BMP-Smad经典信号通路那些下游靶基因调控肺癌的生长、转移和侵袭，还需进一步的研究。

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(责任编辑： 卢萍， 罗森)