用HPLC法同时测定比格犬血浆中地西泮、去甲西泮和氟马西尼的浓度

·论著·

用HPLC法同时测定比格犬血浆中地西泮、去甲西泮和氟马西尼的浓度

李文清，邹豪，钟延强*(第二军医大学药学院药剂学教研室，上海 200433)

[摘要]目的：建立测定比格犬血浆中地西泮、去甲西泮和氟马西尼浓度的HPLC法。方法：采用Kromasil 100-5 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以氯硝西泮为内标，甲醇(A)-水(B)-四氢呋喃(C)为流动相(55∶40∶5)，流速1.0 ml/min，检测波长254 nm；柱温25 ℃。结果：地西泮、去甲西泮和氟马西尼在浓度范围为0.025～1.000 μg/ml时线性良好(r=0.999 9，0.999 0，0.998 9)，日内和日间RSD均<6%(n=5)，回收率接近100%。结论：本方法准确、快速、简便，可用于比格犬血浆中地西泮、去甲西泮和氟马西尼浓度的同时测定。

[关键词]含量测定；地西泮；去甲西泮；氟马西尼；色谱法，高效液相

[中图分类号]R927.2,R971.3[文献标志码]A

DOI：10.5428/pcar20150212

作者简介李文清(男)，硕士生.E-mail：lwqlpp@163.com

doi1.2药品和试剂氯硝西泮对照品、去甲西泮对照品(瑞典Hunge University Hospital临床药理室赠送)，地西泮对照品(含量>98%，山东信谊制药有限公司)，氟马西尼对照品(含量>98%，湖南华纳大药厂有限公司)，比格犬空白血浆(第二军医大学实验动物中心)；碳酸氢钠为化学纯，甲醇、磷酸、乙醚、二氯甲烷为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司)；去离子水(第二军医大学药学院药剂学教研室自制)。

[收稿日期]2015-01-15

Simultaneous determination of diazepam,nordazepam and flumazenil in Beagle dog plasma by HPLC method

ABSTRACT[]Objective：To establish an HPLC method for simultaneous content determination of diazepam,nordazepam and flumazenil in Beagle dog plasma. Methods： The analysis was performed on Kromasil 100-5 C18 column(250 mm×4.6 mm,5 μm).Clonazepam was used as an internal standard.The mobile phase was composed of methanol(A)-water(B)-tetrahydrofuran(C)(55∶40∶5) at a flow rate of 1.0 ml/min.The detection wavelength was 254 nm and the column temperature was 25 ℃.Results: Diazepam,nordazepam and flumazenil were in good linearity within the ranges of 0.025-1.000 μg/ml (r=0.999 9,0.999 0,0.998 9).Intra-day and inter-day RSD were both less than 6%(n=5).Recovery rates were nearly 100%. Conclusion： The HPLC method is accurate,rapid,simple and could be used for simultaneous determination of diazepam,nordazepam and flumazenil in Beagle dog plasma.

[KEY WORDS]content determination;diazepam;nordazepam;flumazenil;chromatography,high performance liquid

[Pharm Care Res，2015，15(2)：126-128]

*通信作者(Corresponding author)：钟延强，E-mail：yqzhong68@163.com

1仪器和试药

1.1仪器Column Oven L-2300/Auto Sample L-2200 HPLC仪(日本Hitachi公司)；Kromasil 100-5 C18色谱柱(瑞典Kromasil公司)；ROTANTA 460R离心机(德国Hettich公司)；VORTEX-QILINBEIER6涡旋仪(江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；AL104万分之一电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

2方法和结果

2.1色谱条件Kromasil 100-5 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-水(B)-四氢呋喃(C)=55∶40∶5，用磷酸调pH=2.2；流速1.0 ml/min；柱温25 ℃；检测波长254 nm；进样量10 μl。

2.2标准储备溶液及内标储备溶液的配制精密称取地西泮、去甲西泮、氟马西尼对照品和氯硝西泮对照品(内标)各10 mg，分别置于100 ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，分别配成100 μg/ml的标准储备溶液，置-4 ℃保存。临用前再混合，并稀释至所需浓度。

采用SPSS 22.0统计软件分析数据。符合正态分布者则采用两独立样本t检验，以均数±标准差进行统计描述；不符合正态分布者则采用秩和检验，以中位数及四分位间距进行统计描述；重复测量设计的计量资料比较采用重复测量设计的方差分析；计数资料比较采用χ2检验，以例（百分率）表示。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.3血样处理取比格犬血浆0.4 ml，加入标准储备溶液和内标储备溶液各0.04 ml，用碳酸氢钠饱和溶液0.4 ml碱化，涡旋30 s后加入乙醚∶二氯甲烷(60∶40)的萃取液，涡旋3 min。取上清液挥干，残渣加100 μl甲醇溶解，进样10 μl，测定样品峰面积。

2.4专属性实验在此色谱条件下，血浆杂质对4种药物无干扰，且4种药物色谱峰分离良好(见图1)。氟马西尼、氯硝西泮、去甲西泮、地西泮的保留时间分别为4.15、7.61、11.44、13.28 min。

2.5线性关系考察取空白血浆0.4 ml，精密加入一定量混合标准储备溶液及内标储备溶液，配成3种药品浓度均分别为0.025、0.05、0.10、0.125、0.25、0.50、1.00 μg/ml血浆样品，并按2.3项下方法处理后进样。以待测药品与内标峰面积之比(A)对血浆浓度(c)进行线性回归，求出各种药品的标准曲线方程(见表1)。

图1　氟马西尼、去甲西泮、地西泮的HPLC谱图 Figure 1　HPLC photograms of flumazenil, nordazepam and diazepam A：空白血浆；B：血浆样品；1：氟马西尼； 2：内标氯硝西泮；3：去甲西泮；4：地西泮

表1　3种药品的标准曲线方程

2.6提取回收率、方法回收率和最低检测限取空白血浆0.4 ml，准确加入一定量混合标准储备溶液及内标储备溶液，配成低、中、高3种浓度的血浆样品作为提取回收率实验用的含药血浆(3种药品浓度均为0.05、0.10、0.50 μg/ml)，按2.3项下方法处理，萃取后药品进样所得的峰面积与对应浓度药品标准储备溶液直接进样所得峰面积的比值即为提取回收率，具体见表2。

表2　回收率和精密度实验结果

取空白血浆0.4 ml，同法配成相同浓度的血浆样品，按2.3项下方法处理，测定峰面积(A)，代入表1标准曲线方程中计算浓度。标准曲线方程计算得到的浓度与样品实际浓度的比值即为方法回收率。每种浓度在1 d内平行测5次，连续测5 d，计算方法回收率及精密度，具体见表2。

以低浓度对照品混入血浆后，测得相应药物的浓度与其响应值作为比较，并以信噪比(S/N)=3为临界值来计算最低检测限。计算得氟马西尼的最低检测限为7 ng/ml，地西泮与去甲西泮的最低检测限为6 ng/ml。

2.7稳定性取空白血浆0.4 ml，同法制备低、中、高浓度血浆样品并按2.3项下方法处理，分别考察室温下放置24 h、-20 ℃下放置14 d、反复冻融3次处理后的稳定性，结果显示所有稳定性实验中其RSD均<8%，表明血浆中地西泮、去甲西泮、氟马西尼在上述3种条件下稳定性良好。

3讨论

样品前处理方法直接关系到检测结果的准确性。本研究对血浆的前处理方法进行了考察，在正常剂量下，地西泮、去甲西泮及氟马西尼在体内的浓度很小，选用液液萃取的方法可以实现血浆中药品的富集，有助于提高检测灵敏度。选用乙醚∶二氯甲烷(60∶40)为萃取液，提取效率高且易挥干，在254 nm波长处杂质干扰小。

地西泮在人体内的代谢产物众多，其中去甲西泮为有药理活性的代谢产物之一，对于中国人来说更是唯一与地西泮消除相关的代谢产物。由于种属差异，地西泮在比格犬体内的半衰期比人短很多[7]，与人相同的是，在比格犬体内，去甲西泮也是与地西泮消除相关的代谢产物。氟马西尼是一种苯二氮受体拮抗剂，对苯二氮受体具有很强的亲合力，可竞争性拮抗苯二氮类药物与受体结合，从而减弱该类药物的药理作用，广泛应用于临床。因此，同时监测3种药物的血药浓度具有重要的临床意义。

【参考文献】

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[3]Zhang Yuan,Reviriego J,Lou YaQing，etal.Diazepam metabolism in native Chinese poor and extensive hydroxylators ofS-mephenytoin: interethnic differences in comparison with white subjects[J].Clin Pharmacol Ther,1990,48(5):496-502.

[4]Brogden R N,Goa K L.Flumazenil. A reappraisal of its pharmacological properties and therapeutic efficacy as a benzodiazepine antagonist[J].Drugs,1991,42(6):1061-1089.

[5]Zedkova L，Rauw G A,Baker G B,etal.A rapid high-pressure liquid chromatographic procedure for determination of flumazenil in plasma[J].J Pharmacol Toxicol Methods,2001,46(1):57-60.

Mao GuiFu. Simultaneous determination of concentration of benzodiazepines in human plasma by HPLC method[J]. Chin J Clin Pharm,2004,13(6):357-360.In Chinese with English abstract.

[7]Klotz U,Antonin K H,Bieck P R.Pharmacokinetics and plasma binding of diazepam in man,dog,rabbit,guinea pig and rat[J].J Pharmacol Exp Ther,1976,199(1):67-73.

[修回日期]2015-03-06

[本文编辑]阳凌燕