海洋微生物代谢产物FGFC1的纤溶促进作用

·论著·

海洋微生物代谢产物FGFC1的纤溶促进作用

傅诗情1，严婷1，吴文惠2，朱全刚3，郭锐华1,陈山乔1，包斌1*

(1.上海海洋大学食品学院海洋药物教研室，上海 201306；2.上海海洋大学食品学院海洋药物与健康食品研究所，上海 201306;3.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院药剂科，上海 200437)

[摘要]目的：研究海洋微生物产生的吡喃并异吲哚酮化合物FGFC1体外和实验动物体内促纤溶作用。方法：采用异硫氰酸荧光素(FITC)-纤维蛋白降解法和急性肺血栓大鼠模型法研究FGFC1体外和体内的纤溶促进作用。结果：在体外FITC-纤维蛋白降解实验中，FGFC1在0.5～25 μmol/L浓度范围内，其纤溶促进作用随着浓度升高逐渐增强；当FGFC1浓度≥25 μmol/L时，其纤溶促进作用维持在最高水平，EC50为5 μmol/L。在大鼠急性肺血栓实验中，FGFC1的剂量为5或10 mg/kg能溶解肺血栓，达到与5 nmol/L剂量单链尿激酶型纤溶酶原激活剂相当的溶栓效果。结论：溶栓药物先导化合物FGFC1具有优良的纤溶促进作用和溶栓效果。

[关键词]FGFC1;纤溶活性化合物；纤溶作用；纤维蛋白(原)；溶栓作用

[中图分类号]R931.77，R973.2[文献标志码]A

DOI：10.5428/pcar20150205

基金项目国家863项目(2011AA09070109)，国家自然科学基金(81341082)

作者简介傅诗情(女)，硕士生.

[收稿日期]2014-03-12

Fibrinolysis promoting activity of a novel metabolic product of marine microbe-FGFC1

FU ShiQing1,YAN Ting1，WU WenHui2,ZHU QuanGang3,GUO RuiHua1,CHEN ShanQiao1,BAO Bin1*(1.Department of Marine Materia Medica，College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306,China；2.Institute of Marine Drugs and Healthy Food,College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University，Shanghai 201306,China;3.Department of Pharmacy，Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200437,China)

ABSTRACT[]Objective：To study in vitro and in vivo the fibrinolysis promoting activity (FPA) of FGFC1，a pyrylium isoindolinone compound of marine microbial origin. Methods：Fluorescein isothiocyanate (FITC)-fibrin degradation and acute pulmonary embolism model of rats were used in vitro and in vivo to study the FPA of FGFC1. Results：In the in vitro FITC-fibrin degradation experiment，FPA of FGFC1 within the levels of 0.5-25 μmol/L increased with the increase of FGFC1. When the level of FGFC1 was ≥25 μmol/L，FPA was maintained at its peak level and the EC50 was 5 μmol/L. In acute pulmonary embolism model of rats，FGFC1 showed thrombolysis activity with an injection dose of 5 mg/kg and 10 mg/kg. The thrombolysis effect of FGFC1 reached pro-urokinase-type plasminogen activator of 5 nmol/L. Conclusion：FGFC1 showed excellent fibrinolysis promotion and thrombolysis effects as a candidate lead compound of thrombolytic agents.

[KEY WORDS]FGFC1；fibrinolytic compound；fibrinolytic effect；fibrin (ogen)；thrombolytic effect

[Pharm Care Res，2015，15(2)：99-102]

*通信作者(Corresponding author)：包斌,E-mail:bbao@shou.edu.cn

溶栓药物如单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(pro-uPA)、重组组织型纤溶酶原激活剂变异体等在消除血栓症的同时，也会带来高纤溶状态而导致出血危险。具有新型溶栓机制的小分子化合物，因具有高效溶栓且出血危险性小的特点，在血栓疾病治疗领域受到研究者的特别关注[1]。从海洋微生物长孢葡萄穗霉菌FG216(StachybotryslongisporaFG216，CCTCC M 2012272)中分离的吡喃并异吲哚酮化合物Fungi fibrinolytic compound 1(FGFC1)能促进pro-uPA和纤溶酶原的相互活化作用[2]。在此基础上，作者通过体外和大鼠体内实验评价FGFC1的纤溶促进作用。

1材料

1.1药品和试剂溶栓药物先导化合物FGFC1为海洋微生物长孢葡萄穗霉菌FG216的代谢产物，FGFC1的化学结构见图1。中文化学名为2,5-双[2-(4，8-二甲基-3，7-二烯壬基)-3，5-二羟基-2-甲基-2，3，4，7，8，9-六氢-7-氧代-吡喃[2，3-e]并-8-异吲哚基]-戊酸，英文名为2，5-bis-[2-(4，8-dimethyl-nona-3,7-dienyl)-3,5-dihydroxy-2-methyl-2,3,4,7,8,9-hexahydro-7-oxo-pyrano[2,3-e]isoindol-8-yl]-pentanoic acid。FGFC1是作者采用盐效应法[3]分离自海洋微生物长孢葡萄穗霉菌FG216的培养液。纤维蛋白原、凝血酶、纤溶酶(美国Sigma公司)；pro-uPA(军事医学科学院惠赠)；氯吡格雷硫酸盐、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC) 购自国药集团化学试剂有限公司。Olympus ix71光学和荧光显微镜(日本Olympus公司)。

图1　FGFC1的化学结构 Figure 1　The chemical structure of the Fungi fibrinolytic compound 1(FGFC1)

1.2实验动物无菌级雌性Wistar大鼠42只，体重180～220 g，购自上海西普尔-必凯动物实验中心[动物生产许可证号：SCXK(沪)201205213]。在相对湿度50%～60%、温度25 ℃的环境喂养，自然昼夜，自由进食和饮水。

2方法和结果

2.1FITC标记纤维蛋白原的方法FITC标记纤维蛋白原方法参照文献[4]。 称取 0.4 g 纤维蛋白原溶解于40 ml的Na2CO3-NaHCO3缓冲液(50 mmol/L, pH 8.5)，在4 ℃避光环境中反应12 h。反应完毕后，使用0.15 mmol/L羟胺终止FITC与纤维蛋白原的结合反应，采用Na2CO3-NaHCO3缓冲液透析除去游离的FITC分子。透析完毕后，将20 ml FITC-纤维蛋白原保存于-80 ℃冰箱，随后向剩下的20 ml FITC-纤维蛋白原溶液中添加0.1 ml含0.1% CaCl2的凝血酶(10 IU/ml)，室温下反应2 h，使FITC-纤维蛋白原转化成网络状的FITC-纤维蛋白，7.5×103×g离心 10 min。取沉淀部分，破碎成<5 μm的颗粒分散于20 ml生理盐水，置于-80 ℃保存。

将10 ng和5 ng FITC-纤维蛋白添加到纤溶酶和pro-uPA反应体系中，于37 ℃遮光条件下反应1 h，7.5×103×g离心10 min。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光成像仪检测FITC-纤维蛋白的降解产物。纤维蛋白原被FITC标记后，经凝血酶转变成网络状FITC-纤维蛋白，再在纤溶酶作用下水解成纤维蛋白降解产物(fibrin degradation products，FDP)(见图2)。图2显示,FITC-纤维蛋白降解产物的片段1、片段2、片段3、片段4与FDP的X-寡聚体(X-oligomer)、D-二聚体、中间片段、片段E在分子量上相近[5]。结果表明纤维蛋白(原)被FITC标记。

图2　FITC-纤维蛋白降解产物的聚丙烯 酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图 Figure 2　Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) photograms of degradation products of FITC-fibrin A：10 ng FITC-FDP；B：5 ng FITC-FDP； FITC：异硫氰酸萤光素；FDP：纤维蛋白降解产物

2.2体外纤溶作用实验将100 μl含有FITC-纤维蛋白原的Na2CO3-NaHCO3缓冲液分别注入96 孔平底平板孔中，在37 ℃下保温24 h 至干燥。向干燥的穴孔里添加75 μl含凝血酶的磷酸盐缓冲液(PBS)(凝血酶浓度为0.68 IU/ml，PBS浓度为20 mmol/L，含150 mmol/L NaCl，pH 7.4)，在37 ℃下维持3 h后，用含有0.1%吐温80的PBS和不含有0.1% 吐温80 的PBS 分别冲洗2次和1次，随后添加含50 μg/ml胶原蛋白的PBS 溶液200 μl，在37 ℃下保温1 h。弃除缓冲液后用于体外纤溶活性的测定。将含有10% 血浆的TBS/BSA溶液(即50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液含100 mmol/L NaCl和10% 牛血清白蛋白溶液)100 μl被顺次添加到穴孔里，随后每个孔分别添加pro-uPA(50 nmol/L)、氯吡格雷硫酸盐(5 μmol/L)和FGFC1(0.5、 5、10、12.5、25、50 μmol/L)各100 μl，每个样品重复10 次，在37 ℃下保温1 h，使用荧光分光光度计在494 nm和520 nm测定荧光强度，以评价FGFC1对于FITC-纤维蛋白的分解量。结果见图3和表1。

4、强化全社会的环境保护意识和林业资源保护意识。林业资源的破坏引发了一系列的生态环境问题，比如，水土流失、土地沙漠化等，相关政府部门应加强林业资源保护工作的宣传力度，鼓励绿色经济和集约型经济的快速发展。加强与其他国家地区关于林业资源保护领域的研究合作，学习借鉴其他国家地区在林业资源管理方面取得的成功经验，不断的调整和完善我国林业资源发展机制。

图3　FGFC1体外纤溶活性 Figure 3　Fibrinolytic effect of FGFC1 in vitro

图3显示，在体外纤溶体系中，随着FGFC1浓度从0.5 μmol/L增加到50 μmol/L，纤维蛋白降解的数量迅速增加并达到最大值，依据作图法得到的EC50为7 μmol/L。

表1　FGFC1处理组和对照组的荧光相对强度

**P<0.01，与生理盐水对照组比较；pro-uPA:单链尿激酶型纤溶酶原激活剂

表1显示，与生理盐水对照组比较，50 nmol/L pro-uPA阳性对照组反应体系的荧光强度显示出极显著差异(P<0.01)。氯吡格雷硫酸盐在浓度为5 μmol/L时，与生理盐水对照组相比没有显著性差异。FGFC1在浓度为0.5～50.0 μmol/L时，与生理盐水对照组相比较具有显著差异(P<0.01)，EC50为5 μmol/L。体外纤溶实验结果表明，FGFC1具有降解纤维蛋白的作用。

2.3体内纤溶作用

2.3.1体内纤溶作用实验设计采用完全随机方法将42只雌性Wistar大鼠分为生理盐水对照组，模型组，低、中、高剂量FGFC1处理组，氯吡格雷硫酸盐阳性对照组和pro-uPA阳性对照组，每组6只。处理前12 h大鼠禁食和禁水。模型组、阳性对照组和FGFC1处理组的大鼠用1%戊巴比妥钠麻醉后，分别从尾静脉注射10 mg/kg FITC-纤维蛋白，4 h后形成大鼠肺栓塞模型。模型构建后，生理盐水对照组和模型组大鼠尾静脉注射给予0.85%生理盐水1 ml/kg；阳性对照组尾静脉注射氯吡格雷硫酸盐5 mg/kg或pro-uPA 2.7 mg/kg；低、中、高剂量FGFC1处理组尾静脉分别注射2.5、5.0 和10.0 mg/kg的FGFC1。

2.3.2体内纤溶作用检验FGFC1的体内纤溶药效用肺组织形态学进行评价。给药12 h后，麻醉并脱颈椎处死大鼠，开胸取肺。按常规组织形态学操作流程制备大鼠肺组织切片，切片制作过程中尽量避光，封片的肺组织在光学显微镜或荧光显微镜下观察[5]，其组织形态学见图4。图4显示对照组(4A)肺泡结构完整，肺泡壁厚薄均匀，毛细血管和细小支气管结构清晰而完整。模型组(4B)肺泡壁增厚，血栓形成，毛细血管明显扩张并伴少量局灶性出血。从荧光显微镜观察到FITC-纤维蛋白诱导形成的血栓斑块聚集在肺毛细血管。肺组织形态学观察结果表明大鼠肺血栓模型形成。

生理盐水对照组、FGFC1处理组和阳性对照组给药24 h后，观察各组肺血栓溶解状况(见图4)。图4C显示，处理24 h后模型组肺组织毛细血管内有荧光物质存在(白色箭头所示)，血栓附近的肺泡壁增厚，血栓没有被溶解。图4D显示，添加50 nmol/Lpro-uPA后，肺组织内没有荧光斑块存在；与图4C相比，肺泡结构完整，肺泡壁均匀，残存着肺血栓溶解后的痕迹(白色箭头)。2.5 mg/kg FGFC1处理组的肺组织切片仍然有明显血栓(图片未显示)，5、10 mg/kg FGFC1处理组见图4E和4F，肺组织基本没有荧光斑块或荧光点存在，肺泡结构基本完整，肺泡壁基本均匀，还能清晰观察到残存着肺血栓溶解后的痕迹(白色箭头)。从尾静脉给予5 mg/kg FGFC1能使肺血栓溶解，10 mg/kg以上剂量的FGFC1能使大鼠肺血栓彻底溶解。

3讨论

本研究从体外和大鼠体内实验两个方面研究了FGFC1的促进纤溶作用，基于纤溶酶原和pro-uPA的相互活化促进作用构筑的体外纤溶实验显示，FGFC1的EC50是5 μmol/L。

由于氯吡格雷硫酸盐被用于冠状动脉疾病和周围性血管疾病相关的抗凝治疗[6]， pro-uPA 在生理环境中可将纤溶酶原转变成纤溶酶来实现血栓溶解[7]。在实验设计中，以溶栓药物pro-uPA作为阳性对照，并参考抗血小板药物氯吡格雷的溶栓药效。体外实验的研究结果显示，FGFC1的剂量为5 μmol/L，与50 nmol/L pro-uPA的纤溶作用相似。体内实验显示，FGFC1剂量为5 mg/kg (相当于5.76 μmol/L)时，与2.7 mg/kg pro-uPA的纤溶作用相似，抗血栓药物氯吡格雷没有显示出类似的纤溶作用。利用FITC标记纤维蛋白原是因为FITC-纤维蛋白能作为模板提供荧光信号，以便于连续监测纤维蛋白溶解情况[8]。在体外实验中，随着FGFC1浓度的增加荧光强度也随之增强，表明FITC-纤维蛋白被降解，FGFC1在5～50 μmol/L表现出特异性的纤溶活性。体外和体内实验显示，FGFC1与pro-uPA具有相同的溶栓效果。

图4　各组大鼠肺组织切片图 Figure 4　The lung tissue slice photograms of rats in each group A:生理盐水对照组(光学显微镜下)；B：模型组(光学显微镜下)；C：模型组(荧光显微镜下)； D:pro-uPA阳性对照组(2.7 mg/kg)；E、F:分别为5和10 mg/kg FGFC1处理组

【参考文献】

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[2]张艳，吴文惠，周培根,等. 海洋微生物来源纤溶活性化合物的筛选及其分离[J]. 中国海洋药物,2008,27(6):39-43.

Zhang Yan,Wu WenHui，Zhou PeiGen,etal. Screening and isolation of fibrinolytic active compound from marine microorganism[J]. Chin J Mar Drugs，2008,27(6):39-43.In Chinese with English abstract.

[3]张启,包斌,倪玲,等. 盐效应分离纤溶活性化合物FGFC1[J]. 中国生化药物杂志,2012,33(5):515-518.

Zhang Qi,Bao Bin,Ni Ling,etal. Isolation of fibrinolytic compound FGFC1 by salt effect[J]. Chin J Biochem Pharm,2012,33(5):515-518. In Chinese with English abstract.

[4]Murciano J C，Harshaw D，Neschis D G,etal. Platelets inhibit the lysis of pulmonary microemboli[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2002,282(3):L529-L539.

[5]Wu J H，Diamond S L. A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization,fibrinogenolysis,or fibrinolysis[J]. Anal Biochem,1995,224(1):83-91.

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[修回日期]2015-03-09

[本文编辑]阳凌燕