异甘草酸镁对成纤维细胞NF-κB信号通路活性的影响

·论著·

异甘草酸镁对成纤维细胞NF-κB信号通路活性的影响

徐建国1，刘继勇2，胡晋红2*

(1.第二军医大学基础医学部病理生理学教研室，上海 200433；2. 第二军医大学长海医院药学部，上海 200433)

[摘要]目的：研究异甘草酸镁(magnesium isoglycyrrhizinate，MgIG)对成纤维细胞核因子-kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)信号通路活性的影响。方法：实验分6组，为空白对照组、TNF-α模型组、地塞米松(dexamethasone，DEX)阳性对照组和0.1、1、10 mg/ml的MgIG组。DEX组和MgIG组分别给予DEX(1 μg/ml)和MgIG(0.1、1、10 mg/ml)预处理4 h后，除对照组外，其余5组加入TNF-α(20 ng/ml)作用1.5 h。提取细胞核蛋白，以免疫印迹法检测NF-κB p65蛋白质表达。提取总RNA，用实时PCR技术检测细胞内IκBα mRNA表达。成纤维细胞经DEX和MgIG预处理4 h后加入TNF-α作用24 h(浓度同上)，用报告基因技术检测NF-κB基因表达。结果：成纤维细胞经TNF-α作用1.5 h后，细胞核内NF-κB p65蛋白质表达量明显增加，IκBα mRNA表达上调；TNF-α作用24 h后，NF-κB基因上调。DEX预处理4 h，可以明显减少TNF-α引起的核内NF-κB p65蛋白质表达和细胞内IκBα mRNA表达，明显降低与TNF-α共作用24 h后NF-κB基因表达。MgIG处理成纤维细胞4 h后，能够明显降低TNF-α作用1.5 h后核内NF-κB p65蛋白质表达量，但对IκBα mRNA表达水平无明显影响。1、10 mg/ml的MgIG能够明显降低与TNF-α共作用24 h后NF-κB基因表达水平。结论：MgIG的抗炎作用与抑制NF-κB p65转位入核和NF-κB基因表达，从而抑制NF-κB信号通路活性相关，但与DEX不同的是MgIG不能改变IκBαmRNA表达水平。

[关键词]异甘草酸镁；NF-κB信号通路；抗炎作用

[中图分类号]R285.5，R966，R967[文献标志码]A

DOI：10.5428/pcar20150107

基金项目国家自然科学基金(81373896)

作者简介徐建国(男)，博士.E-mail：chxdejia@hotmail.com

[收稿日期]2014-01-10

Effect of magnesium isoglycyrrhizinate on NF-κB signaling pathway activity in fibroblasts

XU JianGuo1，LIU JiYong2，HU JinHong2*(1. Department of Pathophysiology，Faculty of Basic Medical Sciences，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；2. Department of Pharmacy，Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

ABSTRACT[]Objective: To investigate the effect of magnesium isoglycyrrhizinate (MgIG) on the activity of nuclear factor-kappa B (NF-κB) signaling pathway in fibroblast cells (FCs). Methods: The experiment consisted of 6 groups: the blank control group, the TNF-α model group, the dexamethasone (DEX) positive control group, and the 3 different concentrations of MgIG groups (i.e. 0.1,1 and 10 mg/ml subgroups). The DEX group and the MgIG groups were pretreated respectively with DEX (1 μg/ml ) and MgIG (0.1, 1 and 10 mg/ml) for 4 h. Then, with the exception of the control group, all the other 5 groups were treated with TNF-α(20 ng/ml) for 1.5 h. Nuclear proteins and total RNA were collected for detecting the expression levels of NF-κB p65 protein by Western blot. Total RNA was collected and used for detecting the expression levels of IκBα mRNA by real-time PCR. Following pretreatment with DEX and MgIG for 4 h, the FCs were treated with TNF-α(with the same dosage as the above) for 24 h, and then the expression levels of NF-κB were detected by reporter gene technology. Results: Following treatment with TNF-α for 1.5 h, the expression levels of intranuclear NF-κB p65 and intracellular IκBα mRNA in FCs were obviously increased, and 24-h treatment with TNF-α also increased the expression levels of NF-κB. Pretreatment with DEX for 4 h could decrease the expression levels of intranuclear NF-κB p65 and intracellular IκBα mRNA gene induced by TNF-α, and could also significantly reduce the expression levels of NF-κB following combined treatment with TNF-α for 24 h. Treatment of FCs with MgIG for 4 h could significantly lower the expression levels of intranuclear NF-κB p65 after pretreatment with TNF-α for 1.5 h. However, no significant effects could be noted on the expression levels of IκBα mRNA. MgIG with dosages of 1.0 and 10 mg/ml could significantly decrease expression levels of NF-κB following combined treatment with TNF-α for 24 h.Conclusion: The anti-inflammatory effect of MgIG was related with the inhibited NF-κB p65 nuclear transposition and NF-κB gene expression, and was also associated with the inhibited activity of NF-κB signaling pathway. When compared with DEX, MgIG failed to exert significant effect on the expression of IκBα mRNA.

[KEY WORDS]magnesium isoglycyrrhizinate; NF-κB signaling pathway; anti-inflammatory effect

[Pharm Care Res，2015，15(1): 22-26]

*通信作者(Corresponding author)：胡晋红，E-mail: hjhong2016@126.com

异甘草酸镁(magnesium isoglycyrrhizinate，MgIG)属于18α-甘草酸中药单体制剂，与具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和保肝活性的异甘草素[1]同属于18α-甘草酸，于2005年开始应用于慢性肝炎的治疗，具有明显的护肝和抑制肝炎发展的作用，对接触性皮炎小鼠MgIG可明显减轻炎症反应[2]，但其具体抗炎机制不详。本研究通过检测MgIG对成纤维细胞(fibroblast cells,FCs) NF-κB p65蛋白质表达的启动子变化情况，以及IκBα mRNA水平变化情况，研究MgIG是否通过改变NF-κB信号通路活性而发挥抗炎作用。

1材料和方法

1.1试剂和仪器异甘草酸镁(粉剂，批号：081003，江苏省正大天晴药业股份有限公司提供)；TNF-α(美国PeproTech公司)；地塞米松(DEX)(粉剂，美国Sigma公司)；UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；PrimeScriptTM RT-PCR Κit(日本Takara公司)；兔多克隆NF-κB p65抗体、小鼠单克隆TATA框结合蛋白(TATA box binding protein，TBP)抗体(美国Santa Cruz公司)；辣根酶标记山羊抗兔IgG(上海碧云天生物技术研究所)；Micro BCA Protein Assay Kit、Supersignal West Femto 显影试剂盒(美国Pierce 公司)；RIPA裂解液(北京百泰克生物技术有限公司)；核蛋白抽提试剂盒(上海康成生物工程有限公司)；QIAGEN Plasmid Midi Κits(德国Qiagen公司)；pGL3-NF-κB-luc质粒和pRL-TΚ-Renilla-luc质粒均由第二军医大学基础医学部病理生理学教研室合成；常见细胞系转染试剂(上海生博生物医药科技有限公司)；IκBα基因及内参还原磷甘油醛脱氢酶(GAPDH)的正向、反向引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)纯化。IκBα 正向引物：5′-CTGAAGGCTACCAACTACAATG-3′，反向引物：5′-CATCAGCACCCAAGGACAC-3；GAPDH正向引物：5′-TGAAGGTCGGTGAACGGATTTGGC-3′，反向引物：5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。Dual-Luciferase Reporter Assay System、Turner DesignsTD-20/20荧光检测仪(美国 Promega公司)；PROTEAN II XL 多板电泳槽(美国Bio-Rad公司)；ABI 7300 Real-Time定量PCR仪(美国ABI公司)；紫外分光光度计(上海光学仪器五厂有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1FCs的分离及培养参照朱全刚等[3]建立的方法：取包皮环切术健康人包皮(第二军医大学长海医院整形外科提供)，置0.05%的醋酸洗必泰灭菌溶液中反复洗涤2次(约5 min)， PBS漂洗3次。在无菌条件下剪去皮下组织，将含表皮及真皮的皮肤组织剪成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的皮块，置于0.2%的分散酶液中，4 ℃消化过夜。次日用无菌镊子揭下已同真皮分离的表皮，剩下的真皮以无菌组织剪充分剪碎，置0.2% Ⅰ型胶原酶溶液中，37 ℃ 消化1 h，吹打制备细胞悬液，200目消毒尼龙筛过滤。200×g离心10 min，弃上清液。加含20%胎牛血清(FBS)及青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 μg/ml)的RPMI1640培养液重悬细胞，以105个细胞/瓶接种于25 cm2的培养瓶内培养，每2～3 d换液一次。待细胞接近融合后传代扩大培养，以0.25%胰蛋白酶溶液消化进行传代，取第7～10代细胞用于实验。

1.2.2分组和给药FCs传代于培养瓶，以10%血清1640培养基培养至70%～80%融合后，换以无血清培养基培养，静息24 h后用于实验。实验分成6组，分别为空白对照组、TNF-α模型组、DEX阳性对照组和0.1、1、10 mg/ml的MgIG组。DEX组和MgIG组分别加入DEX(终浓度1 μg/ml)和MgIG(终浓度分别为0.1、1、10 mg/ml)预处理4 h，然后除对照组外，其余5组FCs均加入TNF-α(终浓度20 ng/ml)再培养1.5 h(TNF-α、DEX及MgIG均以无血清培养基溶解稀释)。经药物处理后的6组细胞用于NF-κB p65蛋白质和IκBα mRNA表达水平的测定。

1.2.3核内NF-κB p65蛋白质测定分别收集6组细胞于试管中，按照核蛋白抽提试剂盒说明书提取各组细胞内核蛋白，通过BCA法进行蛋白质定量，蛋白质稀释至相同浓度后，以8%的SDS-PAGE法分离蛋白质，采用Bio-Rad湿式电转移装置15 V，15 min；85 V，90 min将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，依据Marker对应的65 κD条带和内参TBP的38 κD条带，将PVDF膜剪成合适大小，以含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h，分别加入NF-κB p65抗体、TBP抗体4 ℃过夜，随后TBST洗膜后，加入辣根酶标记马抗山羊IgG(1∶1000)，室温反应10 min。扫描并通过Image J进行灰度分析，NF-κB p65蛋白质含量以NF-κB p65条带和内参TBP条带的灰度比值表示。

1.2.4IκBα mRNA表达水平的检测按照UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明书，抽提25 cm2培养瓶培养的各组细胞总RNA。经紫外分光光度计和甲醛变性琼脂糖凝胶电泳进行RNA纯度和含量测定。参照PrimeScriptTM RT-PCR Κit说明书，进行cDNA反转录，获得的cDNA备用。采用20 μl反应体系进行实时PCR：cDNA template 2 μl，正向引物、反向引物各0.4 μl，DEPC水7.2 μl，SYBR Green 10 μl。实时PCR反应条件：采用2复孔进行反应，预变性：95 ℃ 10 s；变性+延伸：95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40个循环；解离：65 ℃ 15 s。用实时定量PCR仪分析数据，结果用IκBα mRNA和内参(GAPDH)相对表达量表示。

1.2.5报告基因检测技术检测NF-κB基因表达另取FCs传代于24孔板，以10%胎牛血清1640培养基培养至70%～80%融合后，换以无血清培养基培养，静息24 h后，按照质粒转染试剂说明书，各培养孔内加入pGL3-NF-κB-luc质粒(为含有NF-κB启动子链接萤火虫蛋白基因的质粒)1 μg、 pRL-TΚ-Renilla-luc质粒(为含表达稳定的结构基因链接海肾素荧光蛋白基因的参照质粒)10 ng和SunbioTM Trans-EZ常见细胞系转染试剂1 μl，培养8 h后换以无血清DMEM培养基，静息培养24 h。依据1.2.2分组，DEX组和3个浓度MgIG组分别用相应药物预处理4 h，然后除对照组外，其余5组FCs均加入TNF-α再静息培养24 h。按照promega双荧光素酶报告基因检测试剂说明书进行荧光检测[4]，分别记录560 nm处萤火虫荧光强度(fluorescence intensity，FI)和460 nm处海肾素FI，结果用FI560/FI460比值表示，为NF-κB基因相对表达水平。

2结果

2.1MgIG对TNF-α处理后细胞核内NF-κB p65蛋白质含量的影响实验结果如图1所示，TNF-α刺激真皮成纤维细胞1.5 h后，细胞核内NF-κB p65含量明显增多，表明NF-κB信号通路被激活。与单纯TNF-α(模型)组比较，DEX组细胞核内NF-κB p65含量明显降低(P<0.01)，而MgIG同样能够明显降低核内NF-κB p65的含量(P<0.05)，但降低程度小于DEX组，差异有统计学意义(P<0.05)，说明MgIG能够抑制NF-κB p65信号通路的激活，但抑制作用明显弱于DEX。

图1　异甘草酸镁对TNF-α引起成纤维 细胞NF-κB p65表达的影响 Figure 1　Effect of magnesium isoglycyrrhizinate (MgIG) on the expression of NF-κB p65 in fibroblast cells induced by TNF-α 模型组：TNF-α 20 ng/ml；DEX组：DEX 1 μg/ml+TNF-α 20 ng/ml；高浓度MgIG组：MgIG 10 mg/ml+TNF-α 20 ng/ml；中浓度MgIG组：MgIG 1 mg/ml+TNF-α 20 ng/ml；低浓度MgIG组：MgIG 0.1 mg/ml+TNF-α 20 ng/ml; **P<0.01，与对照组比较； △P<0.05， △△P<0.01，与模型 组比较； ▲P<0.05，与DEX组比较；n=3， ±s

2.2MgIG对IκBα mRNA表达的影响如图2所示，与对照组比较，模型组的IκBα mRNA水平明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，DEX组IκBα mRNA水平略有上调，差异无统计学意义(P<0.05)；不同浓度MgIG作用后，仅低浓度组的IκBα mRNA的表达有明显改变(P<0.05)。

2.3MgIG对TNF-α引起成纤维细胞NF-κB基因表达的影响双荧光素酶报告基因检测结果如图2所示。与对照组比较，模型组在TNF-α刺激24 h后，FCs内NF-κB基因表达水平明显上调(P<0.01)，DEX能够抑制TNF-α引起的NF-κB基因水平升高，而中、高浓度(1、10 mg/ml)的MgIG作用后也能明显降低NF-κB基因表达水平(P<0.05)，但这种作用明显弱于DEX组(P<0.05)。

3讨论

甘草是一种传统中药，主要含有三萜类化合物(包括甘草次酸和甘草酸)和黄酮类化合物(包括甘草苷、异甘草素、异甘草酸苷和香豆素)[5]。临床使用其提取物应用于解毒剂、止痛剂、祛痰剂、止咳药、抗氧化剂和抗炎治疗的辅助用药。甘草甜素(甘草酸)是自甘草中提取的三萜类有效成分，临床显示其在治疗肝炎中有重要作用，同时在多种细胞中的实验表明，甘草酸具有抗氧化，减少caspase-3表达并降低其活性，减少细胞凋亡，抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6等炎性细胞因子的表达，且其抗炎作用与促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号系统密切相关[6]。作为其同分异构体的异甘草素对炎症的抑制同样发挥重要作用，在结肠炎相关的肿瘤发生研究中，发现其通过下调PGE2和IL-6信号通路而抑制M2巨噬细胞极化作用[7],但异甘草素对NF-κB信号通路的影响尚不确定。而甘草的另一个黄酮类化合物甘草查尔酮A通过抑制NF-κB p65中丝氨酸的磷酸化，显著抑制LPS信号通路发挥抗炎作用[8]。在作者的研究中发现MgIG发挥抗炎作用可能是通过抑制NF-κB信号通路活性起作用的。

图2　异甘草酸镁对TNF-α引起成纤维细胞IκBα mRNA和NF-κB基因表达的影响 Figure 2　The effects of magnesium isoglycyrrhizinate (MgIG) on the expressions of IκBα mRNA and NF-κB gene in fibroblast cells induced by TNF-α

NF-κB信号通路广泛参与调节免疫反应、炎症反应、细胞分化和凋亡，以及肿瘤形成等多种生物学功能。NF-κB转录因子通常与其抑制物IκBα结合形成复合物，并在胞浆与胞核间达到平衡，信号通路激活后短时间内复合物解聚，大量活性NF-κB迅速转移入核，与相应靶基因位点结合促进其表达。TNF-α是通路激活的主要介导因子，Shin等[9]证实甘草的另一个重要抗炎成分甘草醇通过抑制RAW264.7巨噬细胞的IκBα磷酸化，减少NF-κB p65转移入核，从而发挥抑制NF-κB信号通路活性的作用。在作者的研究中发现，TNF-α作用于FCs 1.5 h后能够明显提高核内NF-κB p65含量，而经MgIG预处理4 h的FCs，这种激活NF-κB p65转位入核的作用被明显减弱。MgIG对TNF-α引起的IκBα mRNA表达水平升高无明显影响，而DEX在与TNF-α联合作用后进一步增加了IκBα mRNA表达，说明IκBα可能没有参与TNF-α刺激作用下MgIG的抗炎作用过程。在NF-κB信号通路中，IκBα表达的增多能够抑制信号通路活性，TNF-α作用在激活NF-κB信号通路后可能负反馈引起了IκBα mRNA表达的增多，DEX在发挥广泛的抗炎过程中可能通过其他途径增加了IκBα mRNA的表达。另外此实验结果表明，MgIG对IκBα mRNA表达的影响不同于甘草醇[9]，可能与Shin等使用的是LPS刺激模型有关。在TNF-α作用24 h后，FCs内NF-κB基因表达水平升高明显，而一定浓度的MgIG能够抑制其表达，这与Shin等的研究结果一致。近几年发现甘草次酸对恶性肿瘤有明显的抑制作用，18β-甘草次酸能够通过PI3K/Akt依赖的NF-κB信号通路的活性，下调MMP-9和VEGF的表达，从而改变肿瘤细胞侵袭能力等生物学活性[10]。甘草制剂这种对NF-κB信号通路活性的抑制作用在作者研究18α-甘草酸MgIG对FCs的影响中也得到证实。

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[修回日期]2014-11-27

[本文编辑]贡沁燕