一种快速测定粗蛋白方法的初步研究

■赵德志 傅永钢 朱凌盈 于 菲 陈少泽

（宁波天邦股份有限公司，浙江宁波 315475）

蛋白质是有机大分子，是由氨基酸组成的一类化合物，是构成机体组织、体细胞的基本成分，是生命的物质基础，是生命活动的主要承担者。蛋白质的种类很多，性质、功能各异，如果动物饲料日粮中蛋白质含量较少，饲料利用率就低，机体的生长就会受限，体重下降；蛋白质缺乏严重还会导致动物的繁殖机能紊乱等。

为了衡量动物饲料的优劣，蛋白质含量首当其冲成为评价饲料营养品质的直接指标。又因为原料中粗蛋白质的含量与饲料中的蛋白质含量存在线性关系，蛋白质的含量决定饲料的品质。为了严

把质量关，原料中粗蛋白含量已成为饲料生产企业日常检测工作中的必检项目。到目前为止，由于没有简便快捷的测量方法，各大公司仍然采用传统的测量方法。但是传统方法在消化过程中存在消化时间长，操作过程比较繁琐以及消化时间和消化温度等因素影响消化率等问题，致使实验存在成本高昂、效率低下等严重缺陷。为了缩短操作时长，规避消化时间和消化温度对实验结果的影响，并从降低实验成本和提高实验效率的多重因素考虑。本实验选取棉粕和鱼粉为样品，以国标法作对照，进行相关研究，旨在简化样品消化过程，提高消化率，提升蛋白质的测定效率，为饲料行业快速测定各原料中粗蛋白的含量提供理论依据和技术支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料

棉粕、鱼粉（均为宁波余姚市售）。

1.1.2 仪器

AL204-1电子天平、粉碎机、40目分样筛、250 ml三角瓶、250 ml消化管、移液管、10 ml量筒、滴定管、半自动定氮仪。

1.1.3 试剂

浓硫酸、无水硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠（江苏彤晟化学试剂有限公司）；硼酸、甲基红、溴甲酚绿、乙醇、盐酸、蔗糖、硫酸铵、酚酞试剂（国药化学试剂有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液的配制

混合催化剂：称取0.4 g无水硫酸铜和6 g硫酸钾，研磨后混匀，备用。

氢氧化钠溶液：准确称取40 g氢氧化钠固体，将其加入到40 ml水中溶解，摇匀后，定容至100 ml，备用。

混合指示剂：将0.1 g甲基红和0.5 g溴甲酚绿分别溶于100 ml无水乙醇中，摇匀后，按1∶1混匀待用。

硼酸吸收液：分别量取0.1%溴甲基绿乙醇溶液10 ml、0.1%甲基红乙醇溶液7 ml和4%氢氧化钠水溶液0.5 ml，将其加到1 000 ml的1%硼酸水溶液中，摇匀待用。

1.2.2 样品的处理

将适量的棉粕和鱼粉进行粉碎后，准确称取上述样品各5组，每组两份。一份按GB/T6432-1994进行处理，另一份采用过氧化氢代替国标法中的混合催化剂，不经过消化炉消化的快速法处理。然后，将上述两种处理样品进行氨的蒸馏。

1.2.3 氨的蒸馏

首先分别向盛有上述溶液的消化管内分别滴加2滴指示剂（对照组加入混合指示剂，实验组加入酚酞指示剂），并向上述消化管中加入过量的氢氧化钠溶液；接着将其安装在半自动定氮仪上，并将定氮仪的冷凝管末端要放入装有25 ml硼酸吸收液的锥形瓶内，然后进行蒸馏。蒸馏时间以吸收液体积达到150 ml时为宜。取下锥形瓶后，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，并将洗液倒入锥形瓶内，最后进行滴定。

1.2.4 滴定

分别向上述吸收液中滴加3～5滴混合指示剂，用0.1 mol/l的标准盐酸溶液进行酸碱中和滴定，滴定至吸收液颜色由蓝绿色变成灰红色为终点。记录消耗的标准盐酸溶液的体积。

1.2.5 空白对照

准确称取0.2 g蔗糖作空白对照，按GB/T6432-1994进行消化、蒸馏和酸碱滴定等，并记录滴定消耗的标准盐酸溶液的体积。

1.2.6 粗蛋白的含量计算

结合空白对照，对棉粕和鱼粉中的粗蛋白含量进行计算。计算公式为：

式中：CP——粗蛋白；

v1——滴定空白时所需标准酸溶液体积(ml)；

v2——滴定样品时所需标准酸溶液体积(ml)；

C——盐酸标准溶液浓度(mol/l)；

V——试样分解液总体积(ml)；

v'——试样分解液蒸馏用体积(ml)；

0.014 0——与1.00 ml盐酸标准溶液相当的氮的质量(g)；

M——试样的质量(g)。

1.2.7 精密度检测

准确称取0.2 g的棉粕和鱼粉粉末各3组，每组两份，分别进行快速法和国标法测试粗蛋白含量，并对数据进行误差分析，验证快速法的系统精密度。

1.2.8 换算系数的确定

精确称取不同质量的棉粕和鱼粉粉末各5组，每组两份，质量分别为0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g，分组利用快速法和国标法对所含粗蛋白进行检测，确定快速法和国标法之间的线性关系即换算系数。

1.2.9 稳定性试验

随机选取5个不同产地的棉粕和鱼粉样品，粉碎后，分别进行国标法和快速法检测，求出两种方法的比值，绘制趋势图。验证快速测定方法的纵向稳定性。

2 结果与分析

2.1 棉粕中粗蛋白测试结果比较

通过预试验得知，当样品中的粗蛋白含量约为80 mg时，滴定终点所消耗的盐酸标准液在10 ml左右。为了便于操作，滴定结果更准确，本试验按表1称取5组棉粕样品，且每组两份：一份用国标法，另一份用快速法测定粗蛋白含量，记录测量结果，并求出国标法和快速法的比值及比值的RSD(%)。试验结果如表1所示。

表1 国标法和快速法测定的粗蛋白含量及其比值(棉粕)

通过表1可以看出，国标法测出的粗蛋白含量为56.65%左右，快速法测得的粗蛋白含量为33.03%以上。两种方法的结果在数值上存在较大差距，通过计算和比较发现两种结果的比值较稳定，约为1.715，且比值的RSD仅为0.086%＜＜1%。说明快速法虽然不能直接测出样品中的粗蛋白含量，但是存在通过快速法和比值相结合计算出粗蛋白总含量的可能。

2.2 鱼粉中粗蛋白测试结果比较

为了排除棉粕结果的偶然性，本次试验选取粗蛋白含量与棉粕相近的鱼粉为原料，随机称取约0.12 g的样品5组，每组两份：一份采用国标法，一份采用快速法，结果如表2所示。

表2 国标法和快速法测定的粗蛋白含量及其比值(鱼粉)

通过表2可以发现，国标法和快速法测出鱼油中的粗蛋白含量同样存在较大差距，且两种方法测得的结果的比值与2.1节中的结果一致，且比值的RSD值为0.049%＜＜1%。说明通过快速法与比值相结合计算样品中粗蛋白总含量的快速方法具有一定的可行性。

2.3 精密度检测

为了进一步确定该方法的可行性，此次试验同时选取棉粕和鱼粉作样品，并精密称取0.200 0 g的上述样品各3组，每组两份，重复上述试验，确定方法的重现性和测量仪器的精密度。结果如表3所示。

表3 快速法的系统精密度分析

从表3中可以看出，试验结果与2.1和2.2的结果一致，比值RSD值仅为0.052%。说明快速法的系统精密度较高，且能够利用该方法准确计算出上述两种原料中的粗蛋白含量。

2.4 标准曲线的建立

为了确定换算系数，试验选取不同质量的棉粕和鱼粉5组，并以快速法测定值为横坐标，国标法为纵坐标，绘制线性关系图，结果如图1所示。

图1 两种方法测得值的线性关系

从图1中可以看出，棉粕和鱼粉的五组数据的线性关系方程为：Y=1.715X-0.041，且R2=0.999 9。由R2值可以看出两种方法的线性关系良好。通过线性方程式中X的系数可以得出两种方法的换算系数为1.715，而且误差仅为0.041%＜＜1%。说明快速法和国标法之间的换算系数稳定可靠，能够准确用于上述两种样品的粗蛋白总量的计算。

2.5 检测方法的稳定性试验

为了探索快速法的适用范围，验证检测方法的横向稳定性，试验选取5种不同产地的棉粕（样本1～5）和5种不同产地的鱼粉(样本6～10)，并对其转换系数的稳定性进行验证。结果如图2所示，不同产地的棉粕和鱼粉样品的换算系数均匀分布在1.715的两侧，且波动范围在0.002以内。根据结果表明，快速法和国标法之间的换算系数在测量不同产地的棉粕和鱼粉样品时波动性较小、稳定性较好，利用快速法和换算系数测定棉粕和鱼粉中粗蛋白含量的方法可靠。

图2 不同产地样品的换算系数的稳定性

3 小结

本试验首先利用快速法和繁琐的国标法分别对棉粕样品的粗蛋白含量进行检测，并对结果进行比较，发现两种方法间的比值关系；其次，用粗蛋白含量略高的鱼粉验证比值关系，并确定应用快速法和比值结合计算样品中粗蛋白总量的可能性；再次，利用棉粕和鱼粉的综合试验结果绘制回归曲线，得出线性方程，确定其自变量X的系数即换算系数；最后，随机选取5个不同产地的棉粕和鱼粉做纵向稳定试验，探究快速法对棉粕和鱼粉粗蛋白的普遍适用性。经过上述试验，最终获得了一种测定棉粕和鱼粉粗蛋白含量的快速方法。

试验结果表明:利用快速法和换算系数相结合，测定棉粕和鱼粉粗蛋白含量的快速方法，有如下优点：即以过氧化氢作催化剂，利用浓硫酸的放热实现消化，且需时短、耗能少；其次，检测结果准确性高、稳定性好，能够为饲料等相关行业快速检测棉粕和鱼粉中粗蛋白含量并出具准确的检测报告；同时，为相关物质含量的测定提供了新思路，开拓了新途径。