乳酸菌发酵有机米糠富硒条件的筛选及优化

■李艳娇 白晓凯 张 敏 金英海 陈石婷 国传福

（1.延边大学，吉林延边 133000；2.珲春市龙裕农业发展集团有限公司，吉林珲春 133300）

硒是人、动物以及植物体必不可少的微量元素之一，它对维持机体正常新陈代谢以及多种疾病的发生均相关，同时，硒是谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心元素，具有抗氧化、延缓衰老，保护、修复细胞的作用，而且硒对增强肌体的免疫能力、抗病能力等方面均有显著的影响。目前，对于补硒的方法大多数均是以无机硒（如亚硒酸钠）化合物的状态进行的，由于无机硒化合物具有毒性高、吸收率低的弊端，所以如何将无机硒转化为有机硒，使微量元素的利用率提高、毒性降低也越来越受到国内外有关学者的关注。

目前对于将无机硒转化为有机硒的方法有生物转化与氨基酸结合、植物自然转化法、微生物转化法（如酵母菌硒）等。自20世纪70年代以来，国内外利用酵母菌将无机的微量元素转化为有机的微量元素已有较多研究，对于利用乳酸菌为载体富集微量元素的文献报道尚少。乳酸菌作为一种有益菌，不仅对食品的独特风味方面有作用，而且对医疗保健作用方面也有明显的效果，它可靠的安全性也已被消费者所认可，富硒乳酸菌作为有机硒的一个新来源，其潜在的发展前景非常广阔。

随着乳酸菌富硒技术的逐渐成熟，越来越多的学者开始寻找生产有机硒的其它方法。我国作为农业大国，农产品资源非常丰富，但对于农副产品的利用，提高其附加价值方面还比较薄弱。本试验以乳酸菌发酵有机米糠富硒，将乳酸菌的某些功能特性与有机米糠中的营养相结合，同时将无机硒以微生物发酵的方法转化为有机硒，开发新型饲料添加剂，以实现农副产品作为新型资源的突破，也将为农副产品在未来的发展中提供一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

由新鲜腌制的辣白菜中提取，所用辣白菜在延边大学超市购买。

1.1.2 培养基

MRS液体培养基：蛋白胨10 g、牛肉粉10 g、酵母浸出粉5 g、磷酸氢二钾（K2HPO4）2 g、柠檬酸三铵2 g、乙酸钠2 g、葡萄糖20 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g、吐温801 ml、蒸馏水1 000 ml，pH值6.2～6.4，121 ℃灭菌15 min。

MRS琼脂培养基：蛋白胨10 g、牛肉粉10 g、酵母浸出粉5 g、磷酸氢二钾（K2HPO4）2 g、柠檬酸三铵2 g、乙酸钠2 g、葡萄糖20 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g、吐温80 1 ml、琼脂15 g、蒸馏水1 000 ml，pH值6.2～6.4，121 ℃灭菌15 min。

发酵培养基：有机米糠、营养液（MRS液体培养基）。

1.1.3 试剂

亚硒酸钠（AR）、浓硝酸、高氯酸、浓硫酸、过氧化氢、甲苯；0.9%NaCl、40%氢氧化钠溶液、5%氢氧化钠溶液、2 mol/l甲酸溶液、0.5%3,3-二氨基联苯胺溶液、5%乙二胺四乙酸二钠溶液。

1.1.4 仪器

高压灭菌锅（HVA-85，日本Hirayama）、超净工作台（SW-CJ-1FD）、恒温培养箱（MJ-150-Ⅰ，昆山 一恒仪器）、电热鼓风干燥箱、冰冻离心机（SIEVA-2，德国HERMLE）、紫外可见分光光度计（UV759，上海佑科）、电子分析天平（MD100-2）。

1.2 方法

1.2.1 菌种的分离、纯化

将泡菜汁用灭菌后的0.9%NaCl分别稀释至10-1～10-6，然后分别进行平板涂布培养48 h，之后挑选具有乳酸菌菌落特征的单一菌落，采用划线分离纯化，纯化若干次后，获得单一菌种。如此纯化若干次后，选取典型的菌落进行活化并扩繁培养。

1.2.2 菌种的活化

挑取纯化几次后的单一菌落，将其接种于MRS液体培养基中，于37℃条件下培养24 h，之后将活化的菌种进行扩繁培养并测定吸光度，直至OD600nm为0.6，即得到种子液。

1.2.3 乳酸菌生长曲线的测定

将活化好的乳酸菌进行液体培养后，测定生长曲线，以确定亚硒酸钠最适的添加时间。种子液以1%的接种量接入到MRS液体培养基中，装液量为50 ml/150 ml，37℃静止培养，采用比浊法，每个4 h测定乳酸菌液的OD600nm值，绘制生长曲线（见图1）。

图1 乳酸菌生长曲线

1.2.4 富集培养

根据需要将亚硒酸钠配好灭菌备用。在超净工作台中将亚硒酸钠溶液按不同量加入到灭菌好的MRS液体培养基中，混匀，在培养箱中继续培养一定时间。

1.2.5 发酵培养

将有机米糠进行分装、灭菌备用。在超净工作台中将培养好的富硒乳酸菌液加到分装好的有机米糠中，搅拌均匀，在培养箱中继续培养。

1.2.6 培养物的洗涤及分离

培养物→离心（25℃、4 000 r/min）20 min，倾去上清液→加入300 ml双蒸水，搅拌均匀→离心（4 000 r/min）20 min，倾去上清液。如此反复几次，将细胞表面的无机硒洗去。最后以4 000 r/min离心20 min获得最终培养物。

1.2.7 测定方法

准确称取0.1 g试样，并加少量水润湿样品，然后加入消化液（双氧水∶高氯酸∶硫酸=3∶3∶1），摇匀，置电炉上消化至终点（若消化不完全可稍冷后补加双氧水继续加热消化至完全，此过程在通风橱内完成）。冷却至室温后，继续加5%EDTA-2Na溶液2 m1，摇匀，用40%氢氧化钠于冷水浴中调pH值至中性，然后定容至100 m1，同法做空白溶液。

1.3 发酵条件的筛选

1.3.1 有机米糠添加量的筛选

将米糠添加量（22～46 g）以外的其它培养条件按培养基装液量为60 ml，接种量3%，种龄16 h，培养温度33℃对发酵培养基进行静置培养。培养36 h后，分别测定每个培养基的生物量，根据生物量来选择合适的米糠添加量。

1.3.2 培养基装液量的筛选

在已筛选好的有机米糠添加量的基础上，接种量、种龄条件不变，将种子液接种于不同装液量的发酵培养基中，温度为33℃的条件下培养36 h，测定发酵培养中乳酸菌的生物量。

1.3.3 接种量的筛选

在发酵培养中分别接入不同接种量的种子液，在温度为33℃的条件下培养36 h，测定乳酸菌生物量，选择最适的接种量。

1.3.4 种龄的筛选

在上述条件基础上，根据不同种龄的种子液对米糠的发酵情况，确定乳酸菌最佳的的菌种种龄。

1.3.5 培养时间的筛选

综合筛选出的最佳发酵条件，将发酵培养基的发酵时间设为24～60 h的梯度，在33℃条件下培养，确定最佳的培养时间。

1.3.6 培养温度的筛选

将培养基在28、31、34、37、40 ℃条件下培养，根据乳酸菌的生物量确定最佳的培养温度。

1.3.7 Na2SeO3添加量的筛选

我们已经根据米糠的发酵程度和乳酸菌的生物量确定了发酵培养基发酵的最佳条件。结合最佳的发酵条件，在培养基中添加不同量的亚硒酸钠，最后由生物量及有机硒生产水平来选择合适的亚硒酸钠添加量。

2 结果与讨论

2.1 有机米糠添加量对富硒乳酸菌生物量的影响

图2 有机米糠添加量对富硒乳酸菌生物量的影响

由图2可知，乳酸菌生物量随着有机米糠添加量的增加而增加，当米糠加量为34 g时，生物量最高；米糠加量大于34 g时，随着添加量的增加，培养基中更多的培养液被米糠利用，不能为乳酸菌的生长提供充足的营养，造成了乳酸菌生物量呈现下降的趋势。因此在培养基中适宜的有机米糠添加量应为34 g。

2.2 培养基装液量对富硒乳酸菌生物量的影响

图3 培养基装液量对富硒乳酸菌生物量的影响

从图3可以看出，装液量对乳酸菌生物量的影响较显著，随着装液量的增加生物量为先上升后下降的生长趋势；培养基中营养液的装液量为55 ml时，生物量最高；由于乳酸菌为厌氧菌，培养液的装液量超过55 ml时，将会抑制乳酸菌的生长，因而导致生物量逐渐下降。

2.3 接种量对富硒乳酸菌生物量的影响

图4 接种量对富硒乳酸菌生物量的影响

由图4可以看出，接种量的大小对乳酸菌生物量的多少有直接的影响。随着接种量的增加生物量逐渐增加，当接种量较大时（接种量大于9%），会造成乳酸菌生长过快，培养基中营养供应不足，使得乳酸菌不能够充分的生长；接种量过小时（接种量小于9%），乳酸菌生长代谢的较慢，进而影响发酵的时间。

2.4 种龄对富硒乳酸菌生物量的影响

图5所示，在0～16 h时，乳酸菌生物量与种龄呈正相关；当种龄为16～20 h时，乳酸菌的生长情况呈直线下降趋势，生物量也迅速减少；在8～16 h时，乳酸菌生长最好，生物量最高。种龄少于8 h时，种子仍处于调整适应的阶段；种龄大于16 h时，开始老化衰退。

2.5 培养时间对富硒乳酸菌生物量的影响

图6所示，乳酸菌生物量随着培养时间的增加而增加，且生长速度较快。当培养到48 h时，生物量最理想，为10.601 g/l；培养48 h后，生物量开始出现下降的趋势，所以，培养时间应为48 h较合适。

图5 种龄对富硒乳酸菌生物量的影响

图6 培养时间对富硒乳酸菌生物量的影响

2.6 培养温度对富硒乳酸菌生物量的影响

图7 培养温度对富硒乳酸菌生物量的影响

由图7可以看出，随着温度的不断升高乳酸菌生长的较为旺盛，生物量也随之增加，当温度达到37℃时，生物量最高；温度大于37℃时，过高的温度对乳酸菌的生长有抑制作用，生物量开始呈现下降趋势。

2.7 Na2SeO3添加量对富硒乳酸菌生物量及有机硒生产水平的影响

从图8可以看出，亚硒酸钠的添加量对乳酸菌生物量和富硒效果均有影响。随着培养基中硒浓度的增加，生物量出现逐渐下降的趋势，相反的是富硒量呈现上升的趋势。因为亚硒酸钠具有一定的毒性，对乳酸菌的生长有抑制作用。

图8 Na2SeO3添加量对富硒乳酸菌生物量及有机硒生产水平的影响

有机硒生产水平（mg/l）=富硒乳酸菌有机硒含量（mg/g）×发酵米糠乳酸菌生物量（g/l）

2.8 发酵米糠营养成分分析

表1 普通有机米糠与乳酸菌发酵有机米糠营养成分分析(%)

由表1可以看出，乳酸菌发酵的有机米糠营养成分与未发酵的普通米糠没有显著性差异。蛋白质和钙的含量略有提高，但差异不显著；其它营养成分均有不同程度的降低，差异不显著(P＞0.05)。

3 结论

综上所述，本试验通过一系列的筛选条件，最终确定了乳酸菌发酵有机米糠富硒的最优条件：有机米糠添加量34 g、培养基装液量55 ml、接种量9%、种龄8～16 h、发酵时间48 h、发酵温度37℃、亚硒酸钠添加量100 mg/l，而且，在此条件下发酵有机米糠，乳酸菌的生物量可达9.94 g/l，有机硒的生产水平为7.46 mg/l。

（参考文献12篇，刊略，需者可函索）