赤金蛋白T30替代南美白对虾饲料中鱼粉的效果研究

■ 刘清兵 曹启猛 于跃芹 王 雷 蒋克勇 刘 梅 王宝杰 张维金 李燕翠

（1.青岛科技大学化学与分子工程学院，山东青岛 266042；2.中国科学院实验海洋生物学重点实验室，山东青岛 266071；3.青岛海洋科学与技术国家实验室海洋生物学与生物技术功能实验室，山东青岛 266071；4.秦皇岛益尔生物推广服务有限公司，河北秦皇岛 066000）

鱼粉蛋白质含量高，适口性好，富含蛋氨酸、赖氨酸等必需氨基酸，而且含有丰富的矿物质和维生素以及未知生长因子等，因此一直被作为水产饲料的主要蛋白质来源。但是近几年来，由于厄尔尼诺现象、海洋污染和过度捕捞等因素使得全球渔业自然资源的衰退，导致世界鱼粉产量逐年下降。然而，随着水产养殖规模的不断迅速增长，对鱼粉的需求量也大幅增加，这就使得全球鱼粉的供应日益紧张，价格不断上升，市场竞争加剧，饲料成本也随鱼粉价格上升而加大。中国是世界上最大的鱼粉使用国和进口国，因此，研究开发能部分或者完全替代鱼粉的新型蛋白源已成为水产养殖业必须面对和解决的问题。

替代鱼粉的蛋白源主要有动物蛋白源和植物蛋白源两大类。植物蛋白源是一种既经济又营养的蛋白源，如大豆制品、豌豆、棉籽饼粕、花生粕、菜粕等，具有来源广、品质稳定、价格低廉和营养丰富等特点。使用植物蛋白源替代饲料中鱼粉的研究已有大量的报道，杨奇慧等研究发现在鱼粉含量为30%、粗蛋白质含量为40%的南美白对虾基础饲料中，可以用10%的花生粕替代鱼粉。何大庆等研究发现，可以用美国去皮豆粕替代南美白对虾饲料中60%的鱼粉。但植物蛋白源也有很多缺点，包括必需氨基酸缺失、蛋白质含量偏低和抗营养因子存在等，尤其是含有的抗营养因子如蛋白酶抑制剂、各种凝集素、纤维素、抗原化合物等,长期使用会导致水产动物的生长受到抑制，有些会影响饲料中营养元素的利用使得蛋白质利用率降低，有些则会影响饲料的适口性,有些会使水产动物生长速度降低，有些会提高水产动物的饵料系数，有些甚至会使水产动物的肝脏、肠道产生病变。

20世纪60年代,Newey等首次提出了肽可以被完整吸收的证据，但是直到20世纪80年代，小肽能够被完整吸收的观点及其生理作用才引起人们重视，并且越来越多的科研人员对其进行了相关研究，取得了许多成果。研究表明,蛋白质在消化道内的分解产物大部分是小肽（主要是二肽和三肽），小肽可以直接被机体完整吸收并被组织利用，并且小肽作为蛋白质的主要分解产物,在氨基酸的消化、吸收和代谢中起着重要作用。在水产动物中,已有学者研究了小肽对凡纳滨对虾、西伯利亚鲟、异育银鲫等生长性能和免疫能力的影响。

赤金蛋白（Pure-Gold Peptide）T30是以禽血为主要原料，以酶解大豆蛋白为载体，采用生物酶工程技术制取的功能性蛋白肽。其原料经过高压灭菌预处理后进行酶解、瞬间高温灭菌、低温干燥，产品质量稳定，使用安全。赤金蛋白T30中的生物活性肽及游离氨基酸（酸溶蛋白）绝对含量高于35%，其中小肽含量12%以上，且生产成本比鱼粉低，对于循环经济和资源的高值化利用具有重要意义。

南美白对虾学名凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)，别名凡纳对虾、白脚虾等，其适应能力强、杂食性、广盐性，具有生长速度快、肉质鲜美、饲料利用效率高、加工出肉率高等优点，养殖模式多样，是我国最主要的对虾养殖种类，其营养与饲料研究开发也是业内关注的焦点。本文通过实验室及生产性养殖对比试验，测定分析生长指标、营养成分、消化酶活力和血清免疫指标等，研究赤金蛋白T30活性肽在南美白对虾养殖中的营养与免疫功效，确定其最佳应用技术，为其尽快应用于生产实际提供指导和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验采用的基础饲料配方为烟台大乐饲料有限公司生产的对虾大棚专用饲料（按照养殖进程分为0#、1#和2#料）。基础饲料组成及营养水平见表1。

赤金蛋白T30由秦皇岛益尔生物技术推广服务有限公司所属的大连益尔保成肽业有限公司提供。T30的肽分子量分布见表2，营养成分分析见表3。

表1 基础饲料组成及营养水平（%）

表2 赤金蛋白T30肽分子量分布

表3 赤金蛋白T30营养成分分析（干物质基础）

基础饲料配方中0#/1#料和2#料的鱼粉用量分别为32%和30%，赤金蛋白T30分别替代基础饲料配方中鱼粉用量的15%和30%，即：0#/1#料中的使用量为4.8%和9.6%，2#料中的使用量为4.4%和8.8%。由于T30的粗蛋白含量与鱼粉接近，故各鱼粉替代组饲料的粗蛋白含量与对照组一致。

1.2 试验动物与试验设计

试验动物为南美白对虾优质一代虾苗，试验初始体重为(0.155±0.01)g，放苗密度400尾/m2。试验地点为青岛瑞滋海珍品发展有限公司的工厂化养殖车间，每个养殖池5 m×5 m，水深1.0～1.2 m。

分别以T30替代饲料配方中鱼粉用量的15%（试验组B）和30%（试验组C）为试验组，以基础饲料配方（试验组A）为对照组。将9个养殖池随机分成3组，每组3个重复，每个养殖池中放养健康南美白对虾苗10 000尾。

1.3 试验管理

试验期内，每天按照对虾体重的8%～10%投料，每天喂4次，分别在06：00、10：00、16：00、20：00，并记录投喂量、水温、pH值、盐度、溶氧等水质参数。池内安放饵料台，投料1 h后，观察对虾摄食情况，及时调整投料量。每天观察对虾摄食、蜕壳、生长情况。试验用水为经过沉淀、砂滤的海水，养殖期间每天早上排污并补充新鲜海水。试验期间连续充氧。定期测定水中氨氮、亚硝酸盐含量。试验期间水温为27.0～31.0 ℃，盐度为30～32，溶解氧＞8.0 mg/l，pH值为7.8～8.3，氨氮含量＜0.30 mg/l，亚硝酸盐含量＜0.20 mg/l。试验自放苗入池开始直至养殖结束，共计60 d。

1.4 样品采集

每隔20 d自各试验池中随机捞取南美白对虾20尾，测量其体长、体重，并计算平均值。第60 d试验结束时，于养殖池中随机捞取南美白对虾20尾，称量每只虾的体重和体长，取出肝胰脏后迅速放于液氮中保存，再转移到-80℃超低温冰箱中存放，以测定肝胰脏相关酶活力指标。用2.5 ml注射器吸取1 ml抗凝剂，从围心腔中抽取1 ml虾血，将血液放置1.5 ml Eppendorf管中，4℃离心，吸取上清液进行血清免疫指标的测定。随机取3只虾，保存于-20℃冰箱中，用于虾体成分分析。

1.5 生长指标测定

试验期第20、40、60 d时，随机取对虾称重并计算平均体重（精确到0.01 g），计算增重率和特定生长率；试验第60 d时，取样计算饲料系数和成活率等。

增重率（WG，%）=100×(Wt-W0)/W0；

特定生长率（SGR，%/d）=100×[(lnWt-lnW0)]/t；

饲料系数（FCR）=FI/W；

成活率（SR，%）=100×FN/IN。

式中：Wt——试验结束时南美白对虾的平均重量(g)；

W0——试验开始时南美白对虾的平均重量(g)；

FI——试验期间虾摄食饲料的干物质总重量(g)；

W——对虾的增重量(g)；

t——养殖时间(d)；

FN——试验结束时南美白对虾尾数；

IN——试验开始时南美白对虾尾数。

1.6 样品分析

1.6.1 常规营养成分分析

分别采用烘干失重法(GB 5009.3-2010)、凯氏定氮法(GB 5009.3-2010)、索氏抽提法(GB/T 5009.3-2003)和高温灼烧(GB 5009.4-2010)测定虾体的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分。

1.6.2 肝胰脏消化酶活力的测定

从-80℃超低温冰箱中取出肝胰脏样品，转移到4℃冰箱中，待其解冻后备用。准确称量肝胰脏0.5 g，然后按1∶4的质量体积比加入预冷的PBS缓冲液，在冰浴条件下匀浆，在4℃下静置4 h，然后4℃、8 000×g条件下离心30 min，所得上清液即为粗酶液。收集粗酶液分装于1.5 ml离心管中，将其置于4℃冰箱中保存，并于24 h内测完消化酶(脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶)活力。

采用G-250考马斯亮蓝染色法测定粗酶液蛋白浓度。消化酶的活力以比活力表示，定义为每克酶所具有的酶活力单位数，即酶单位/mg蛋白(U/mg蛋白)。

采用azacation（偶氮酪蛋白）水解法测定粗酶液的蛋白酶活力，蛋白酶活力单位定义为：30℃下，pH值7.2条件下，蛋白酶水解1%azocation的底物，将每分钟OD值增加0.001所需要的酶量定义为一个酶活力单位。

采用3，5二硝基水杨酸（DNS）法测定粗酶液纤维素酶活力。纤维素酶活力单位（U）定义为：pH值7.2，在37℃条件下保温30 min，纤维素酶分解0.5%CMC，将每分钟OD值增加0.001所需要的酶量定义为一个酶活力单位。

采用3,5二硝基水杨酸（DNS）法测定粗酶液淀粉酶活力。淀粉酶活力（U）：pH值7.2，在37℃条件下保温30 min，淀粉酶分解1%淀粉溶液，将每分钟OD值增加0.001所需要的酶量定义为一个酶活力单位。

采用对硝基苯酚法测定粗酶液脂肪酶活力。本试验以对硝基苯磷酸脂（P-NPP）为底物测定粗酶液脂肪酶的活力。脂肪酶活力单位（U）：pH值7.2，在37℃条件下保温10 min，脂肪酶水解对硝基苯磷酸酯（P-NPP），将每分钟OD值增加0.001所需要的酶量定义为一个酶活力单位。

1.6.3 血清免疫指标的测定

酸性磷酸酶(ACP)活力、碱性磷酸酶（AKP）活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力和溶菌酶活力采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定，具体测定方法按照说明书进行。

1.7 数据统计与分析

试验数据用“平均值±标准误(means±SE)”表示。先使用Microsoft Excel 2010进行统计，再采用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，并结合最小显著差数法（LSD法）进行多重比较，判断平均数之间的差异显著性，P＜0.05表示差异显著。

2 结果分析

2.1 赤金蛋白T30替代鱼粉对南美白对虾生长指标的影响

试验期间对虾的生长测量结果见图1。赤金蛋白T30替代饲料中不同比例鱼粉对南美白对虾生长性能的影响见表4。

图1 不同饲料处理对南美白对虾生长性能的影响

由图1可以看出，在初始体重和体长相同的情况下，随着饲养时间的增加，试验B组的体长和体重增加的最多，其次是C组，A组相对增加较少。

由表4可以看出，在初始体重相同的前提下，喂养20 d，B组的末体重、增重率、特定生长率显著高于A组和C组(P＜0.05)；C组的末体重、增重率和特定生长率均高于A组，但差异性均不显著（P＞0.05）。喂养40 d，B组的末体重显著高于A组和C组(P＜0.05)，增重率B组显著高于A组和C组(P＜0.05)，但A组和C组间差异不显著（P＞0.05）；特定生长率B组＞A组＞C组，A组和B组、A组和C组间差异性不显著（P＞0.05），B组和C组间差异性显著(P＜0.05)。喂养60 d，B组的末体重、增重率、特定生长率最高，C组次之，A组最低，但三组间差异性不显著（P＞0.05）；成活率B组＞A组＞C组，B组和A组间差异性不显著（P＞0.05），但B组和A组与C组间差异性显著(P＜0.05)。

表4 赤金蛋白T30替代鱼粉对南美白对虾生长指标的影响

2.2 赤金蛋白T30替代鱼粉对南美白对虾虾体成分的影响（见表5）

表5 赤金蛋白T30替代鱼粉对南美白对虾虾体成分的影响(%)

由表5可以看出，随着赤金蛋白T30替代鱼粉比例的提高，虾体粗蛋白含量显著提高（P＜0.05），粗脂肪含量显著降低（P＜0.05），水分含量降低但差异不显著（P＞0.05），灰分含量B组和C组无显著性差异（P＞0.05），但显著高于A组（P＜0.05）。

2.3 赤金蛋白T30替代鱼粉对南美白对虾肝胰脏消化酶活力的影响(见表6)

表6 赤金蛋白T30替代鱼粉对南美白对虾肝胰脏消化酶活力的影响(U/mg prot)

由表6可知，各试验组南美白对虾肝胰脏的蛋白酶活力、脂肪酶活力、纤维素酶活力差异不显著（P＞0.05）。淀粉酶活力C组与B组显著高于A组(P＜0.05)。

2.4 赤金蛋白T30替代鱼粉对南美白对虾血清免疫指标的影响(见表7)

表7 赤金蛋白T30替代鱼粉对南美白对虾血清免疫指标的影响

由表7可以看出，各试验组的酸性磷酸酶活力和溶菌酶活力差异不显著（P＞0.05）；B组的碱性磷酸酶活力显著高于A组和C组（P＜0.05）；B组的总超氧化物歧化酶活力均高于A组和C组，且和A组差异显著（P＜0.05），和C组差异不显著（P＞0.05），C组高于A组且差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 赤金蛋白T30替代鱼粉对南美白对虾生长指标的影响

本试验结果表明，使用赤金蛋白T30替代饲料中适量的鱼粉能改善南美白对虾生长性能，包括提高南美白对虾的增重率、特定生长率，提高成活率，降低饲料系数等。上述结果和使用小肽替代鱼粉喂养青鱼、银鲫、西伯利亚鲟、南美白对虾等的研究结果一致。赤金蛋白T30适宜替代鱼粉用量为15%，对南美白对虾的生长起到促进作用，同时可降低饲料成本。但过多添加（30%）则会影响其生长并降低饲料转化率，这可能是由于T30中氨基酸组成的平衡性与鱼粉有所差异，虽然T30比植物蛋白源的氨基酸组成相对平衡，但其赖氨酸和蛋氨酸的含量低于鱼粉中的含量。小肽的添加量越多，饲料中所含赖氨酸和蛋氨酸的量与使用鱼粉的差异也越大，因此，饲料中必需氨基酸与非必需氨基酸间的比例差异越大，对生长可能产生一定抑制作用。另外，本试验中随着饲养天数的增加，各试验组间的差异性变得不显著，可能是由于对虾养殖密度过高，规格增加后没有及时疏苗所致。试验结束时，15%替代组的成活率与对照组相近，但是30%替代组的成活率偏低，可能是赤金蛋白T30替代了过多的鱼粉，使得饲料中的营养平衡改变，未知生长因子含量偏低，从而影响南美白对虾的生长和成活率。

3.2 赤金蛋白T30替代鱼粉对南美白对虾虾体成分的影响

本试验结果表明，随着赤金蛋白T30替代鱼粉用量的增加，南美白对虾虾体粗蛋白的含量呈上升趋势，且差异显著，这和刘沛等对青鱼的研究结果不一致。随着赤金蛋白T30替代鱼粉用量的增加，南美白对虾虾体粗脂肪的含量呈下降趋势，且差异显著，这和徐奇友等对哲罗鱼稚鱼的研究结果一致。随着赤金蛋白T30替代鱼粉用量的增加，南美白对虾虾体灰分呈现先增加后减少的趋势，且试验组与对照组间差异显著，试验组间差异不显著。随着赤金蛋白T30替代鱼粉用量的增加，南美白对虾虾体的水分含量差异不显著。本试验中随替代量的增加，蛋白质含量上升，和其他人的研究不一致，其原因有待进一步探究。脂肪含量随着替代量的升高，呈下降趋势，说明饲料中添加赤金蛋白T30有可能降低虾体的脂肪沉积作用。总体而言，赤金蛋白T30替代鱼粉后对虾体营养起到了正面作用（高蛋白、低脂肪），对其他成分无显著影响。

3.3 赤金蛋白T30替代鱼粉对南美白对虾肝胰脏消化酶活力的影响

本试验结果表明，赤金蛋白T30替代不同的鱼粉用量，对南美白对虾肝胰脏的蛋白酶活力和纤维素酶活力均无显著影响。随着替代比例的提高，淀粉酶活性显著提高，并且两个试验组和对照组有显著差异，但两试验组间没有显著差异。杨奇慧等研究发现，当用花生粕替代鱼粉蛋白质比例高于20%时，肝胰脏淀粉酶的活性显著提高。随着替代比例的提高，对虾肝胰脏脂肪酶活性呈现先增加后降低的趋势，赤金蛋白T30替代鱼粉用量的15%时最高，这与张帆等研究使用豆粕替代鱼粉对大黄鱼消化酶活力影响一致。小肽的使用，可能会刺激水产动物消化酶的分泌，从而促进营养物质的消化与吸收，但与养殖对象、替代比例等密切相关，有待进一步的研究。

3.4 赤金蛋白T30替代鱼粉对南美白对虾血清免疫指标的影响

本试验结果表明，赤金蛋白T30替代不同的鱼粉用量，对南美白对虾血清中酸性磷酸酶和溶菌酶活力均无显著影响，并且都呈现先增加后降低的趋势。15%替代组的碱性磷酸酶活力显著高于A组和C组，而C组的碱性磷酸酶活力高于A组但差异不显著。ACP、AKP和溶菌酶是吞噬细胞杀菌的物质基础，能够形成水解酶体系，破坏和消除侵入体内的异物，起到机体防御的功能。结果表明，使用赤金蛋白T30替代鱼粉用量的15%，可以诱导ACP、AKP和溶菌酶活力的增加，从而提高了机体的免疫功能。超氧化物歧化酶（SOD）可以催化超氧离子自由基进行歧化反应，减少自由基对机体的损害，是机体清除氧自由基的重要保护酶。本试验中15%替代组的SOD活力最高，且高于C组，说明适量的赤金蛋白T30可以提高SOD活力。

4 结论

赤金蛋白T30替代南美白对虾配方中鱼粉用量15%，提高了南美白对虾的增重率、特定生长率，可以促进南美白对虾的生长，提高成活率、降低饲料系数。同时显著提高了虾体营养成分中粗蛋白的含量、显著降低了脂肪含量，对虾体营养具有一定改善作用。赤金蛋白T30替代鱼粉用量15%，显著提高了南美白对虾肝胰脏淀粉酶的活力，对部分血清免疫指标有显著促进作用。生产实际中用赤金蛋白T30替代部分鱼粉，可大大降低饲料配方成本，缓解鱼粉资源的不足，提升饲料使用效果。因此，可以用赤金蛋白T30替代南美白对虾饲料中鱼粉用量的15%。

（参考文献27篇，刊略，需者可函索）