猪TCAP基因启动子克隆与活性分析

乔木 程碧军 武华玉 黄京书 刘贵生 彭先文 李良华 吴俊静 梅书棋

摘要：为了寻找鉴定与猪骨骼肌生长发育相关的基因，克隆了猪TCAP基因1 662 bp的核心启动子序列，通过软件预测，构建了7个缺失片段表达载体，转染PK细胞，确定了其核心启动子序列位于转录翻译起点上游0～155 bp之间。

关键词：猪;TCAP基因;启动子;转录活性

中图分类号：Q78        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）23-6051-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.065

Cloning and Activity Analysis of Pig TCAP Gene Promoter

QIAO Mu1a，CHENG Bi-jun1b，WU Hua-yu1a，HUANG Jing-shu2，LIU Gui-sheng1a，PENG Xian-wen1a，Li Liang-hua1a， WU Jun-jing1a，MEI Shu-qi1a

（1a. Institute of Animal and Veterinary Science;1b. Technical Institute of Agricultural Economy， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China; 2. Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Hubei Provence， Wuhan 430070， China）

Abstract：It has great implications for identifying pig genes which have function in skeletal muscle growth and development. The promoter sequences （1 662 bp） of pig TCAP gene was cloned， 7 plasmid vectors with deletion of different fragments to transfect PK cell was constructed， and found the core promoter sequence of TCAP gene was located in 0～155 bp upstream.

Key words：pig; TCAP gene;promoter;transcriptional activity

TCAP蛋白（Titin-cap，Telethonin）是一种在横纹肌和心肌中特异性表达的蛋白，是肌联蛋白激酶的作用底物，绑定于肌联蛋白Z1-Z2区[1]，通过连接和支撑肌联蛋白为其他肌纤维蛋白提供结合位点，从而在调节肌原纤维的组装中起到重要作用[2]。该蛋白除在肌原纤维的组装中扮演重要角色外，对肌原纤维的翻转同样起着重要作用[3]。研究发现该基因与肌肉萎缩、心肌症、肌肉营养不良、心肌损伤等相关[4-6]。

TCAP基因定位于人染色体HSA17q1.2，由2个外显子和1个内含子组成，编码167个氨基酸[7]。Cheong等[8]克隆了牛的TCAP基因，编码了166个氨基酸，其与人和鼠的TCAP基因相似性达到95.8%和95.2%;牛TCAP基因第一内含子和第二外显子的多态位点与肌肉大理石纹评分显著相关。黄京书[9]分离克隆了猪TCAP基因部分序列，本试验采用PCR方法克隆猪TCAP基因的启动子序列，并研究TCAP基因启动子不同区段的转录活性，为研究TCAP基因表达调控机制奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

大白猪（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所原种猪场）、梅山猪（英山县绿源养猪专业合作社）、长白猪（华中农业大学试验猪场）前腔静脉采血，采用传统的苯酚/氯仿提取法提取DNA。

PK细胞由动物胚胎与分子育种湖北省重点实验室保存（采用含10%热灭活小牛血清的DMEM培养基，于5%CO2孵箱内37 ℃常规培养）。PGL3-Basic载体购自Promega公司;限制性内切酶、连接酶购自TaKaRa公司;DMEM培养基、Lipofection AMINE 2000转染试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2  启动子的扩增与克隆测序

根据猪染色体序列设计引物TF/TR，TF：CCTGGGAGGGAAGGTCAA，TR：CTGGGCTTTGTGC

TCTGTC，引物由北京奥科生物有限公司合成。以大白猪基因组DNA作为启动子克隆的反应模板，PCR扩增体积为25 μL，体系中各组分的浓度为50 ng模板DNA、1×PCR mix、0.5 mmol/L引物，PCR的运行程序为：预变性94 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35个循环;最后72 ℃继续延伸10 min。

PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。将目的条带用Gel Extraction Kit试剂盒纯化回收，回收后的PCR产物片段与pMD-18T Vector System连接并转化DH5α，重组克隆子送北京奥科生物有限公司测序。

1.3  缺失片段重组质粒的构建

根据软件Proscan的预测结果及人TCAP基因启动子结构，设计7对引物（表1），构建7个缺失片段，并在引物中引入XhoⅠ和MluⅠ酶切位点，反应体系与程序同上。将纯化的PCR产物经XhoⅠ和MluⅠ酶切后连接到PGL3-Basic载体中转化大肠杆菌DH5α，提取转化质粒经双酶切和测序鉴定。

1.4  细胞转染

培养的PK细胞经胰蛋白酶消化后，接种于24孔板中，培养至50%～60%融合后，在清洁的EP管中用无血清培养基OPTI-DMEM稀释1 μL 质粒DNA至60 μL，加入5 μL转染试剂，混匀后室温下孵育5～10 min，同时用l mL PBS清洗24孔板中的细胞1次，EP管中加入350 μL含20% FBS血清的细胞培养基，吹打2次混匀后，立即加入到24孔板中，轻轻摇匀后置于37 ℃、5% CO2孵箱培养6 h，吸走含转染复合物的培养基，并用l mL PBS清洗细胞1次，裂解并收集细胞进行荧光素酶活性检测。

1.5  荧光素酶活性测定

彻底吸取各孔培养基，然后用PBS冲洗3遍，每孔加入细胞裂解液110 μL，冰上孵育30 min，刮下细胞并迅速收集到冰预冷的1.5 mL微量离心管中。4 ℃ 12 000 r/min离心2 min，取上清液。将荧光素酶底物分析缓冲液和收集的上清液置于室温。取10 μL荧光素酶底物和50 μL细胞裂解液加入96孔板，轻轻混匀后迅速放入HTS7000多孔板阅读器。在激发波长为430 nm、发射波长为550 nm条件下读取荧光值。

1.6  数据分析

荧光素酶活性测定3次重复，结果以x±s来表示，用t检验对数据进行分析，P<0.05视为差异显著。

2  结果与分析

2.1  猪TCAP基因启动子扩增结果

以大白猪、长白猪、梅山猪基因组DNA为模板，利用引物TF/TR进行PCR反应，获得1 662 bp的序列（图1），经过序列比对和启动子预测软件分析，确定得到的序列为猪TCAP基因的启动子序列。

2.2  猪TCAP基因启动子缺失片段重组质粒的构建

以大白猪TCAP基因启动子区扩增产物的克隆菌液为模板，利用上游引物GSP分别与下游引物1-7进行扩增，获得7个大小分别为99、155、310、546、912、1 140、1 428 bp的片段（图2），产物经XhoⅠ和MluⅠ酶切纯化后，连接到经同样酶切的PGL3-Basic载体中转化大肠杆菌DH5α，提取转化质粒，经双酶切（图3）和测序鉴定，证实插入片段为目的片段。

2.3  TCAP基因启动子活性分析

将带有TCAP基因启动子不同区段的重组质粒转染PK细胞，测定荧光素酶活性（图4）。结果表明，与阴性对照PGL3-Basic空载体相比，7个不同缺失片段重组质粒的转录活性提高了60～130倍，说明这7个片段均具有转录活性。插入片段长度为155 bp的质粒，其转录活性最高（P<0.05），说明TCAP基因启动子核心区域位于翻译起点上游0～155区域。

3  讨论

随着新基因的不断发现，研究新基因的功能是当前的热点，研究基因的表达调控是基因功能研究的一个内容。阐明基因表达调控的机制，不但可以深入了解生物的生长发育调控，而且对于转基因的研究也具有十分重要的意义。启动子区的克隆是对基因表达调控进行研究的必要条件，通过启动子研究，许多新基因功能在信号传导等重要调节过程的地位被逐渐挖掘出来。TCAP基因是调控肌原纤维组装的重要调控基因之一，研究表明该基因与动物的肌肉发育等性状存在显著的相关[9]，因此克隆该基因的表达调控区域，研究该基因的表达调控模式，为深入研究该基因功能和其在生产中的应用提供理论基础。

对TCAP基因翻译起始位点上游1 662 bp DNA序列进行分析，结果发现其中含3个可能的启动子区域，以及MyoD、C/EBP、STAT、MEF2等转录因子的结合位点;在翻译起点上游0～155 bp范围内存在正调控因子MyoD、MEF2的转录结合位点。根据预测结果与重要转录因子结合位点构建了7个缺失载体，研究结果显示该基因的核心启动子区域位于翻译起点上游0～155区域内，这与该区域存在正调控转录因子结合位点的结果一致，并与Proscan软件预测结果相吻合。

参考文献：

[1] GREGORIO C C ， TROMBIT？魣S K， CENTNER T， et al. The NH2 terminus of titin spans the Z-disc： Its interaction with a novel 19-kD ligand （T-cap） is required for sarcomeric integrity[J]. Cell Biol， 1998，143：1013-1027.

[2] MAYANS O， VAN D V， WILM M， et al.Structural basis for activation of the titin kinase domain during myofibrillo genesis[J].Nature， 1998， 395（6705）：863-869.

[3] SCHRODER R， REIMANN J， IAKOVENKO A， et al. Early and selective disappearance of telethonin protein from the sarcomere in neurogenic atrophy[J]. Journal of Muscle Research and Cell Motility， 2001， 22：259-264.

[4] MOREIRA E S， WILTSHIRE T J， FAULKNER G， et al.Limb-girdle muscular dystrophy type 2G is caused by mutations in the gene encoding the sarcomeric protein telethonin[J].Nat Genet，2000，24（2）：163-166.

[5] KNOLL R， HOSHIJIMA M， HOFFMAN H M， et al. The cardiac mechanical stretch sensor machinery involves a Z disc complex that is defective in a subset of human dilated cardiomyopathy[J]. Cell， 2002， 111（7）： 943-955.

[6] BOS J M， POLEY R N， NY M， et al.Genotype-phenotype relationships involving hypertrophic cardiomyopathy associated mutations in titin， muscle LIM protein， and telethonin[J]. Mol Genet Metab， 2006， 88（1）：78-85.

[7] VALLE G， FAULKNER G， DE ANTONI A， et al. A novel sarcomeric protein of heart and skeletal muscle[J]. FEBS Lett， 1997，415（2）：163-168.

[8] CHEONG H S， YOON D H， KIM L H， et al. Titin-cap （TCAP） polymorphisms associated with marbling score of beef [J].Meat Science，2007，77（2）：257-263.

[9] 黄京书.猪四个候选基因的分离，鉴定及分子标记与杂种优势的关联分析[D].武汉：华中农业大学，2007.