辐照对中华绒螯蟹过敏蛋白生化特性的影响

廖涛+杨锴+耿胜荣+熊光权+陈玉霞+李新+鉏晓艳+白婵+程薇

摘要：为研究辐照脱除中华绒螯蟹过敏性的效果，对中华绒螯蟹的过敏原粗提液辐照0～45 kGy后进行SDS-PAGE、荧光光谱、紫外光谱分析和免疫印迹鉴定，研究辐照对过敏蛋白浓度、浊度、疏水性、免疫原性的影响。结果表明，与未辐照的中华绒螯蟹过敏原相比，辐照后蛋白浓度降低，浊度增高，从3 kGy时浊度的变化与蛋白浓度变化呈正相关，随蛋白浓度增高或降低，浊度也逐渐增加或减少。从低剂量到高剂量辐照时，疏水性逐渐增强，到20 kGy时疏水性达到最大值，然后随着辐照剂量的增加疏水性降低。低剂量辐照时过敏蛋白的浓度变化不大，到20 kGy时，过敏蛋白含量明显降低;45 kGy时，过敏蛋白基本被完全降解。免疫印迹试验结果表明，过敏蛋白的免疫原性随着辐照剂量的增加而降低。

关键词：中华绒螯蟹;过敏原;辐照;生化特性

中图分类号：S981.22        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）23-5973-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.046

Effects of Irradiation on Bio-chemistry Properties of Allergen in Chinese Mitten Crab

LIAO Tao，YANG Kai，GENG Sheng-rong，XIONG Guang-quan，CHEN Yu-xia，LI Xin，

ZU Xiao-yan，BAI Chan， CHENG Wei

（ Institute of Agro-Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Engineering Research Center for Farm Products Irradiation，Wuhan 430064，China）

Abstract： The effects of irradiation reducing allergenicity of Chinese Mitten Crab （Eriocheir Sinensis） were studied by SDS-PAGE， Fluorescence Spectrum， Ultraviolet Spectrum technology and Western-Blotting were used to analyze the change of allergy protein concentration， turbidity， surface hydrophobicity and immunogenicity after irradiated among 0～45 kGy dosage. The results showed that protein concentrations decreased compared with the unirradiated Chinese mitten crab allergen， turbidity changes were positively related to protein concentrations， and turbidity also gradually increased or decreased when the protein concentrations increased or decreased. From low dose to high dose irradiation， the surface hydrophobicity gradually increased and reached the maximum value at 20 kGy， however surface hydrophobicity reduced from 20～ 45 kGy. The electrophoretogram of SDS-PAGE showed that allergic protein concentration had a slight change at low dose irradiation， siginificantly decreased at 20 kGy， and the allergic protein was completely degraded when the dose reached 45 kGy. The results of Western-Blotting indicated that allergic protein immunogenicity reduced with the increase of irradiation dose.

Key words：Chinese mitten crab; allergen; irradiation; bio-chemistry properties

食物过敏，也称为食物变态反应、消化系统变态反应、过敏性胃肠炎等，是由于进食某种食物后造成的不良反应，有呕吐、腹泻及皮肤起疱等症状，严重的食物过敏能引起窒息、急性哮喘、过敏性休克甚至死亡。在联合国粮农组织提出的八大类易过敏食物中，虾蟹等甲壳类水产品是最重要的一类[1-3]。中华绒螯蟹又称河蟹、毛蟹、清水蟹、大闸蟹或螃蟹，味道鲜美，营养丰富，是一种经济蟹类，是中国传统的名贵水产品之一。随着消费人群的扩大，随之而来的蟹类过敏报道屡见不鲜[4-7]。

食品辐照是20世纪发展起来的一种专门用于食品类的灭菌保鲜技术，辐照可使蛋白质等生物大分子发生解聚、交联、裂解以及空间结构、构象的改变。继而抗原决定簇遭到破坏，过敏蛋白原有免疫原性丧失。机体的免疫细胞接收不到足够的生物信息或无法识别抗原分子不能引发机体的免疫应答，从而免疫发生过敏反应引起疾病[8]。目前，辐照脱敏在虾[9-11]、花生[12，13]、红豆[14]等过敏食品上开展了大量研究，认为辐照改变了蛋白质的二级结构，使蛋白质分子展开，疏水基团暴露，形成多聚体，从而抗原性下降[15]。但有关中华绒螯蟹过敏原组成及辐照脱敏效果鲜见报道。因此，研究辐照降低中华绒螯蟹过敏原过敏性对保护消费者食品安全有着积极的意义。endprint

本试验对中华绒螯蟹组织蛋白中引起食物过敏症的主要过敏原进行初步提取和免疫学活性分析，并对其进行辐照处理，从而观察其物理化学性质的变化，为进一步研制蟹类食物过敏症的检测试剂和脱敏制剂提供依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料与试剂

鲜活的中华绒螯蟹在中百仓储购买，蟹过敏患者特异性血清由同济医院变态反应科提供。

主要试剂：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠、甘氨酸、N，N，N′，N′-四甲基二乙胺、酶标二抗、牛血清蛋白、8-苯氨基-1-萘磺酸（ANS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、二氨基联苯胺（DAB）、溴酚兰、考马斯亮兰R-250、考马斯亮蓝G-250、巯基乙醇、丽春红等，均为分析纯及生物纯。

1.2  试验仪器

仪器：钴-60辐射源（装源量30万居里），湖北辐照实验中心;荧光分光光度计（F93），上海棱光技术有限公司;荧光检测器（RF-20A）、紫外分光光度计（TU-1810PC），北京普析通用仪器有限责任公司;电泳仪（DYY-6C型、DYCZ-24D型）、转移芯（DYCZ-40D型），均为北京市六一仪器厂产品;高速冷冻离心机（SPX-Ⅱ），湖南湘仪离心机仪器公司。

1.3  样品处理

1.3.1  蟹肉粗提液的制备  根据参考文献[16]进行蟹肉粗提液制备，略有改进。中华绒螯蟹去壳取肌肉，称取一定量的肌肉，剁碎，置于干净烧杯中，加入4倍体积的冷丙酮（-20 ℃预冷过夜），搅拌1 min，置于4 ℃冰箱中静置30 min，弃去丙酮，再加入4倍体积的冷丙酮，搅拌1 min，置于4 ℃冰箱中静置30 min，弃去丙酮，再重复丙酮操作一次，弃去丙酮后，将烧杯置于通风处使丙酮挥发，待丙酮挥发完后，加入2倍体积的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液，搅拌30 min后，置于4 ℃冰箱中过夜。第二天将其取出，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，上清液即为蛋白粗提液。

1.3.2  辐照处理  取27个10 mL透明塑料离心管，每管装6 mL蛋白粗提液，每3个一组，分为9组，进行室温辐照，辐照剂量为0、3、6、9、12、15、20、30、45 kGy，对其进行编号，编号与辐照剂量相同。实际吸收剂量以硫酸亚铁剂量来跟踪，分别编号。

1.4  测定方法

1.4.1  辐照后中华绒螯蟹过敏蛋白浓度、浊度变化  参照顾可飞等[17]的操作方法略作改进。浊度测定：辐照后各管吸取20 μL溶液，加入装有2 mL考马斯亮蓝 G-250和180 μL去离子水的试管中，混匀后于 595 nm处测定其吸光度。过敏蛋白浓度测定：辐照后的过敏蛋白溶液于 280 nm下测定其吸光度。采用紫外分光光度计测定二者吸光度。

1.4.2  疏水性变化  参照顾可飞等[17]的操作方法。向2 mL辐照后的过敏蛋白溶液中加入15 μL的8-苯氨基-1-萘磺酸（ANS ）液，混匀，室温放置2 h，激发波长为385 nm，进行发射波长在420～550 nm范围内的荧光强度扫描。采用荧光光度计测定过敏蛋白的疏水性。

1.4.3  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  将辐照后的过敏蛋白溶液50 μL与等体积的上样缓冲液进行混合后，于沸水浴中煮沸3～5 min，分离胶浓度为15%，电泳电压为100 V，浓缩胶浓度为4%，电泳电压为60 V，待指示剂离开凝胶后停止电泳，将胶片取下后，放入考马斯亮蓝R-250中过夜染色，然后回收染色液，加入脱色液中脱色至背景无色。

1.4.4  中华绒螯蟹过敏原鉴定  利用15%的分离胶，5%的浓缩胶将过敏原蛋白质分离后，取出凝胶，与剪好的Whatman滤纸和硝酸纤维素膜一起放入蛋白转印缓冲液中浸润30 min，按（+）支持板-无纺纤维垫-两层滤纸-硝酸纤维素膜-凝胶-两层滤纸-无纺纤维垫-支持板（-）的顺序安装转印芯，按红（阳极）、黑（阴极）方向将其放入转印槽中，倒入转印缓冲液，在90 V下转印2.5 h，取出硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜放入丽春红中染色5 min，以确定蛋白质是否转上去。确定转上后，将染色的硝酸纤维素膜用去离子水漂洗，直至红色褪去。洗干净后的硝酸纤维素膜放入封闭液中4 ℃过夜，弃去封闭液，加入20倍稀释（V/V）的一抗室温反应2.0 h，TBST洗膜6次，每次5 min（6×5 min），洗完后加入1 000倍稀释（V/V）的二抗室温反应2.0 h，TBST洗膜6×5 min，洗完后加入新配置的DAB溶液显色5 min，以水冲洗终止反应。

1.5  数据统计

用ANOVA 和Spjotvoll-Stoline test软件对数据进行统计分析。

2  结果与分析

2.1  中华绒螯蟹粗提液浓度

中华绒螯蟹粗提液595 nm处吸光度值以牛血清白蛋白为标样，得到的标准曲线为Y=0.013 9X+1.141 4，R2=0.989 7，其中Y为吸光度，X为牛血清白蛋白含量（μg）。10 μL中华绒螯蟹粗提液样品在595 nm处吸光度为1.283，根据公式计算得到中华绒螯蟹粗提液样品的浓度为1.02 mg/mL。

2.2  中华绒螯蟹粗提蛋白组分

中华绒螯蟹组织蛋白经脱脂和PBS提取后，采用SDS-PAGE进行分离。中华绒螯蟹粗提液有12条可辨蛋白条带，分子质量从18.6～89.1 kDa 不等，其中主要的蛋白条带为18.6、20.1、23.4、27.1、37.2、41.7、43.1、47.9、53.7、67.6、75.9和 89.1 kDa（图1）。endprint

2.3  中华绒螯蟹蛋白组分过敏原的鉴定

中华绒螯蟹粗提物电转移至NC膜，转印后的凝胶经考马斯亮蓝染色后蛋白质电泳胶片无可见蛋白质条带，证明转印较完全。蟹过敏患者阳性血清池对中华绒螯蟹粗提蛋白的免疫印迹结果显示，粗提物中能与中华绒螯蟹过敏患者血清反应的组分有7种，分子质量在37.2～89.1 kDa之间，主要有 37.2、43.1、47.9、53.7、67.6、75.9和 89.1 kDa（图2）。

2.4  辐照对中华绒螯蟹过敏蛋白溶液浓度和浊度的影响（n =3）

随着辐照剂量的增加，中华绒螯蟹过敏蛋白浓度呈先增加后降低的趋势，浊度随剂量的变化趋势与浓度大致相似（表1）。其原因可能是辐照导致部分蛋白发生变性，使疏水基团外露，发色基团蓝移动，同时吸光度增加[18]。辐照剂量为15 kGy时浓度和浊度都达到最大值，辐照剂量达到20 kGy时，辐照使蛋白变性形成大的颗粒而部分沉淀，过敏原溶液经辐照后其水溶性下降，使得蛋白浓度降低，浊度也随之降低。

2.5  辐照对中华绒螯蟹过敏蛋白疏水性的影响

荧光探针8-苯氨基-1-萘磺酸（ANS）在水溶液中的荧光强度很弱，但是当ANS与蛋白质表面的疏水性基团相结合时，荧光强度就会增强。通过荧光强度的变化可以反映蛋白质疏水性的变化。如图3所示，随着辐照剂量的增加，中华绒螯蟹过敏蛋白溶液的疏水性呈先增加后下降的趋势，在辐照剂量20 kGy时达到最大值。推测疏水性变化的原因可能是蛋白质的疏水基团随辐照剂量的增加逐渐外露，当剂量继续增加时，蛋白分子发生降解或交联，疏水基团减少。这与蛋白辐照后浊度的变化有一定的关系。

2.6  辐照对中华绒螯蟹过敏蛋白浓度的影响

十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果（图4）表明，与未辐照的溶液相比，辐照后过敏蛋白的含量随辐照剂量的增加而下降，到20 kGy时，过敏蛋白含量下降明显，30 kGy时仅看见75.9 kDa大小的蛋白条带;大于30 kGy的处理几乎看不见任何条带，大分子蛋白条带的减少伴随小分子蛋白混合物的增加;新生成的蛋白条带分子质量在42 kDa左右;当辐照剂量达到20 kGy时，新生成的条带也开始降解，并无新的蛋白条带产生，当辐照剂量达到45 kGy时所有的条带完全消失。

2.7  辐照对中华绒螯蟹过敏蛋白抗原性的影响

随着辐照剂量的增加，过敏蛋白的浓度和免疫原性均逐渐降低（图5）。未辐照样品出现3条较为明显的蛋白条带（图5a），过敏患者血清免疫反应中出现6条明显的印迹（图5b），这说明未辐照样品有5种不同分子质量蛋白组分发生过敏反应，分布在37.2～89.1 kDa之间。当辐照剂量为9 kGy时，蛋白含量减少，且在35～55 kDa之间因降解产生新的混合蛋白成分;对于过敏患者血清中，除原蛋白组分的隐约3条印迹外，新组分未发现有过敏反应，并不具有免疫原性，而且随着辐照剂量的增加，过敏蛋白与血清的反应越来越弱，45 kGy辐照后的NC膜上基本看不到痕迹。标准分子量没有与过敏患者血清发生反应，也可以排除蛋白的非特异性结合。可见，辐照9 kGy可明显降低过敏蛋白的免疫原性，辐照20 kGy时中华绒螯蟹蛋白溶液失去过敏性。

3  讨论

蟹在中国广泛分布，蟹类及其制品含有丰富的蛋白质，并且味道鲜美，深受人们的喜爱，但对于这种常见的水产品，严重过敏者甚至会发生过敏性休克。在对中华绒螯蟹过敏原的研究中，陈伟等[19]的研究显示中华绒螯蟹中的主要过敏原是分子质量为 66 kDa和76 kDa的蛋白，吴兴达[20]的研究则认为中华绒螯蟹的主要过敏原为分子质量在35、41、48、66 kDa的蛋白。本试验结果表明，分子质量在 37.2～89.1 kDa之间的7种蛋白为中华绒螯蟹的主要过敏原，与文献报道的分子量范围一致，可能由于中华绒螯蟹地域不同，导致了过敏原分子质量的差异性。

国内外的研究发现，已知食物主要过敏原对热、酸、蛋白酶稳定，常规的加工处理很难达到清除过敏原的要求[21]。辐照处理对虾过敏蛋白、鸡蛋中的卵粘蛋白（OM）、牛奶中的α-乳球蛋白（BLG）都有破坏作用，均能使它们的过敏性下降，抗原表位破坏[22-24]。辐照处理使蛋白质一级结构中的部分氨基酸发生分解或氧化，部分蛋白质大分子还会发生解聚、交联、裂解以及空间结构、构象的改变，破坏蛋白质在生物体中的结构，蛋白质的生物学功能结构遭到破坏，丧失生物活性[14，25-27]。本试验在利用辐照技术处理中华绒螯过敏蛋白的研究中发现，随着辐照剂量的增加，蛋白浓度降低，蛋白组分含量下降，浊度增高，过敏性逐渐下降。SDS-PAGE电泳中，3～15 kGy辐照后，产生分子质量约42 kDa的蛋白条带，20 kGy辐照后过敏蛋白降解的趋势明显，45 kGy辐照后，蛋白已经降解完全，且免疫印迹结果显示抗原决定簇被掩盖或破坏。

明胶蛋白质含水条件下辐照会导致游离氨基酸残基含量的持续下降，交联度逐渐增加、特性粘度下降和不溶物的出现[28]。本试验中过敏蛋白溶液辐照后也有类似的发现。过敏蛋白浊度随剂量的增加呈先增加后下降的趋势，这是因为过敏原溶液经辐照后发生交联和变性反应，导致水溶性下降，浊度增加，随着交联反应程度的增加，小分子不溶物聚集、沉淀，浊度又随之降低。浊度的变化使蛋白质浓度测定时受到一定程度的影响。

疏水基的相互作用在维持蛋白质的三级结构稳定性方面起重要作用，蛋白的疏水性和巯基含量的变化反应蛋白的变性程度。李迎秋等[29]发现，高压脉冲电场处理时间越长，大豆分离蛋白的疏水性和巯基含量越高。本试验中，辐照后蛋白的疏水性增加的现象与前人研究部分相似，不同之处是，过敏原蛋白受到辐照后，疏水性随辐照剂量的增加呈先升后降的趋势，推测疏水性变化的原因是，蛋白质的疏水基团随辐照剂量的增加逐渐外露，当剂量继续增加时，蛋白分子发生降解或交联，疏水基团减少，具体结论有待进一步分析。endprint

4  小结

中华绒螯蟹蛋白粗提液蛋白分子质量范围为18.6～89.1 kDa，蛋白条带分子质量分别为18.6、20.1、23.4、27.1、37.2、41.7、43.1、47.9、53.7、67.6、75.9和89.1 kDa;与中华绒螯蟹过敏患者血清反应的蛋白组分有7种，分子质量在 37.2～89.1 kDa之间，主要有 37.2、43.1、47.9、53.7、67.6、75.9和 89.1 kDa。中华绒螯蟹蛋白粗提液蛋白浓度和免疫原性随辐照剂量的增加而降低，疏水性和浊度随辐照剂量的增加呈先上升后下降的趋势。

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