栗疫病菌对苯醚甲环唑和氟硅唑的敏感性分析

何秀娟+徐育海+邱文明

摘要：采用菌丝生长速率法检测来自湖北罗田板栗产区14株栗疫病菌对苯醚甲环唑和氟硅唑的敏感性。结果表明，苯醚甲环唑对14株栗疫病菌株的EC50范围为0.027 9～0.124 0 μg/mL，平均为0.064 5 μg/mL;氟硅唑对上述菌株的EC50为0.024 6～0.218 6 μg/mL，平均为0.072 5 μg/mL。对不同敏感性菌株的适生性进行检测。结果表明，抗药性较强的菌株菌丝生长速率和致病力显著高于敏感菌株;抗性菌株传代培养10代后的EC50没有显著性变化，其抗药性状可以稳定遗传。

关键词：栗疫病;抗药性;苯醚甲环唑;氟硅唑

中图分类号：S432        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）23-5915-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.030

The Sensitivity of Chestnut Blight to Difenoconazole and Flusilazole

HE Xiu-juan， XU Yu-hai， QIU Wen-ming

（Institute of Fruit and Tea， Hubei Academy of Agricultural Science， Wuhan 430064， China）

Abstract：The sensitivities of chestnut blight to difenoconazole and flusilazole fungicides were determined in 14 isolates collected from Luotian in Hubei Province by measuring the mycelial growth on PSA media. The results showed that the 50% effective concentration values（EC50） of difenoconazole ranged from 0.027 9 to 0.124 0 μg/mL，with a mean of 0.064 5 μg/mL.And the EC50 values of flusilazole ranged from 0.024 6 to 0.218 6 μg/mL，with a mean of 0.072 5 μg/mL.The fitness test of different sensitive isolates showed that the mycelial growth rate of resistant isolates was faster and the pathogenicity was higher than sensitive isolate significantly. After being subcultured for ten generations，EC50 of the resistant isoltes remained at the same level，the resistance of the isolates may be stable.

Key words： chestnut blight; fungicide resistance; difenoconazole; flusilazole

栗疫病又称栗胴枯病、栗干枯病，该病引起板栗树皮腐烂、枯枝或全树枯死，甚至大片栗树死亡，是著名的森林病害，广泛发生于亚洲、欧洲和北美洲。栗疫病在中国分布十分广泛[1]，生产上板栗的病虫害管理环节较为薄弱，因栗疫病严重发生而造成的毁园现象时有发生，并呈上升趋势，栗疫病的防治是栗树栽培中亟待解决的问题。

国家开展了栗疫病的防治研究，在栗疫病抗病育种[2]、弱病毒菌株生物防治[3]等研究方向均取得了一定的进展。中国位于栗疫病菌的起源中心[4]，栗疫病菌资源遗传背景和营养体多样性复杂[5]，上述防治方式在实际生产中的应用还存着一定的困难[6，7]。栗疫病病原菌是寄生隐丛赤壳菌[Cryphonectria parasitica （Murr.） Barr]，属子囊菌亚门。栗疫病防治难度大，一旦发生很难根除。苯醚甲环唑和氟硅唑是三唑类杀菌剂，具内吸性，其作用机理为影响甾醇类生物合成，使菌体细胞膜功能受到破坏，由于广谱高效的抗菌活性和中等的抗药性风险，被广泛用于农业生产中植物真菌病害的防治[8，9]。在板栗实际生产中，化学杀菌剂应用较少，早期的化学药剂对栗疫病防治效果不明显，尚没有登记用于板栗疫病防治的化学药剂。本研究从湖北罗田县受栗疫病侵染的板栗园分离得到栗疫病菌株并开展相关研究[10，11]，本试验在室内条件下测定分离获得的14株栗疫病菌株对苯醚甲环唑和氟硅唑的敏感性，探索化学药剂在栗疫病防治上的应用潜力，以期为栗疫病的化学防治提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  供试药剂

苯醚甲环唑（瑞德丰世典水分散粒剂，有效成分10%），广东省东莞市瑞德丰生物科技有限公司;氟硅唑（福星乳油，有效成分400 g/L），美国杜邦公司。

1.2  供试菌株与培养条件

从湖北罗田板栗产区采集栗疫病病斑树皮样本，经组织分离、鉴定与单孢纯化，保存菌株14株，用于栗疫病药剂敏感性试验。试验基础培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）。

1.3  离体抑菌活性测定

采用菌丝生长速率法测定板栗疫病菌株对药剂的敏感性。将用去离子水稀释好的药剂混入60 ℃以下未凝固的PSA培养基中，使药剂在培养基中最终含药量达到目标浓度（苯醚甲环唑的浓度梯度为0.150 0、0.100 0、0.075 0、0.050 0、0.037 5 μg/mL，氟硅唑的浓度梯度为0.600 0、0.300 0、0.150 0、0.075 0、0.037 5 μg/mL），倒平板。从在PSA平板上培养7 d的菌株菌落边缘取直径为5 mm的菌丝块接种于含药平板中心处，每个处理设3次重复。于25 ℃培养7 d后，用十字交叉法取菌落直径（mm），取平均值再减去原菌块直径（5 mm）后，计算抑制率。试验设2次重复。采用几率值法，通过浓度对数值（x）和抑制率机率值（y）之间的线性回归关系计算化学药剂对板栗疫病各菌株的抑制中浓度（EC50）。endprint

抑制率=■×100%

1.4  不同敏感性菌株的菌丝生长速率

将不同敏感性菌株在PSA平板上培养7 d，用直径为5 mm的打孔器取菌落边缘打出菌饼转到PSA平板上，25 ℃培养，培养7 d时测量各菌株的菌落直径，比较不同敏感性菌株之间的菌丝生长速率。试验重复3次。

1.5  不同敏感性菌株致病力差异

将不同敏感性菌株在PSA平板上培养7 d，取5 mm菌饼，在离体板栗叶片上用接种针刺伤，伤口避开叶片主脉，将每一菌株和无菌PSA块（CK）分别接种于以上处理的离体叶片正面，接种后的叶片放入托盘内（盘底铺上无菌湿纱布），盘口覆上保鲜膜，于25 ℃培养，培养3 d后记录发病率和病斑直径。试验重复3次。

1.6  抗性菌株遗传稳定性测定

将抗性较强的菌株于直径为90 mm的无药平板上培养至长满培养皿，在菌落边缘打取直径5 mm的菌饼再接种至无药平板上，视为转接1代，连续转接10代。采用菌丝生长速率法分别测定各菌株的第0代、第5代和第10代对药剂的敏感性，并计算其抗性指数EC50，评估抗性菌株在转代过程中的抗性遗传稳定性。

1.7  数据处理

采用DPS 7.0.2数据统计软件进行EC50计算和差异显著性分析。

2  结果与分析

2.1  栗疫病菌对苯醚甲环唑的敏感性检测

采用菌丝生长速率法测定14株栗疫病菌株对苯醚甲环唑的敏感性，EC50结果见表1，栗疫病菌株的EC50范围为0.027 9～0.124 0 μg/mL，平均为0.064 5 μg/mL，其中，菌株CRY-3的EC50最大，约是平均值的2倍，菌株B-4-3的EC50最小，菌株CRY-3和B-4-3在含有不同浓度苯醚甲环唑PDA培养基上菌落生长特征见图1。

2.2  栗疫病菌对氟硅唑的敏感性检测

采用菌丝生长速率法测定14株栗疫病菌株对氟硅唑的敏感性，EC50见表2，栗疫病菌株的EC50为0.024 6～0.218 6 μg/mL，平均为0.072 5 μg/mL，其中菌株3-1-1的EC50最大，是平均值的3倍，而菌株B-4-3的EC50最小，菌株CRY-3和B-4-3在含有不同浓度苯醚甲环唑PDA培养基上菌落生长特征见图2。

2.3  不同敏感性菌株的适生性测定

2.3.1  不同敏感性菌株菌丝生长速率的比较  将对苯醚甲环唑抗性较强的菌株CRY-3、对氟硅唑抗性较强的菌株3-1-1和对两种药剂抗性较差的菌株B-4-3分别接种在PSA培养基上，培养7 d后比较菌落生长速率，菌株B-4-3菌丝较为稀疏，生长速率显著低于其他两个菌株，结果见表3。

2.3.2  不同敏感性菌株的致病力差异  将菌株CRY-3、3-1-1和B-4-3分别接种到板栗品种金栗王叶片，比较接种3 d后板栗叶片的发病率和病斑直径，结果见表3。菌株B-4-3的发病率和病斑直径均显著低于其他2个菌株。

2.3.3  抗性遗传稳定性  对菌株CRY-3和菌株3-1-1分别进行继代培养后，比较菌株的第0代、第5代和第10代对药剂的敏感水平，结果见表4和表5。菌株CRY-3和菌株3-1-1在第5、10代时的EC50无显著变化。

3  小结与讨论

2种化学杀菌剂对板栗疫病均表现出较好的抑制效果，14个菌株对2种化学药剂菌表现出较大的敏感性差异，表明同一地区不同菌株敏感性差异较大。苯醚甲环唑和氟硅唑同属于三唑类化学药剂，试验中14个菌株对苯醚甲环唑和氟硅唑的EC50平均值无明显差异，而单个菌株对2种药剂的EC50存在一定差异，菌株B-4-3对2种药剂均表现出敏感性。试验中表现出对药剂抗性较强的菌株CRY-3和3-1-1菌丝生长速率快、致病力强，研究中还发现2株抗性较强的菌株菌丝生长旺盛、菌落厚、产孢慢，而抗性较弱的菌株B-4-3菌丝生长量较少、产孢量大，可能是菌落生长特性与菌株致病力和抗药性分化存在一定的相关性。

多种化学杀菌剂和用药方式被尝试应用于栗疫病的防治[12，13]，研究表明内吸性化学药剂对栗疫病有较好的防治作用。化学防治在栗疫病的防治上应用较难，早期的化学杀菌剂使用剂量大且使用方法不当，容易产生药害。本试验所用三唑类化学杀菌剂具内吸性、用量少等优点，室内试验结果表明，2种杀菌剂对栗疫病菌有较好的防治效果，该类药剂在板栗疫病防治中具有较大的应用潜力，应用于田间栗疫病防治并配合改进使用方法还有待进一步研究。

参考文献：

[1] 周而勋，王克荣，陆家云.中国东部11省（市）栗疫病的发生条件[J].南京农业大学学报，1993，16（3）：44-49.

[2] 刘  伟，康  明，黄宏文.中国板栗EST-SNP和抗栗疫病候选基因分析及同源比对[J].植物科学学报，2012，30（1）：55-63.

[3] C？魪CILE R， STEFAN L， ALAIN S. Dominance of natural over released biological control agents of the chestnut blight fungus Cryphonectria parasiticain south-eastern France is associated with fitness-related traits[J]. Biological Control，2010（53）：55-61.

[4] PROSPERO S， LUTZ A， TAVADZE B， et al. Discovery of a new gene pool and a high genetic diversity of the chestnut blight fungus Cryphonectria parasiticain Caucasian Georgia[J].Infection， Genetics and Evolution，2013，20：131-139.

[5] LIU Y C，MILGROOM M G. High diversity of vegetative compatibility types in Cryphonectria parasiticain Japan and China[J].Mycologia，2007，99： 279-284.

[6] PING DING，FU-XIU LIU，CHEN-XIAN XU.Transmission of Cryphonectria hypovirus to protect chestnut trees from chestnut blight disease[J].Biological Control，2007，40：9-14.

[7] 李  涛，叶  云，华朝晖，等.栗疫病菌菌株间营养体不亲和性影响对病毒传递的效率[J].江苏农业科学，2011，39（2）：174-177.

[8] 华乃震.杀菌剂苯醚甲环唑的进展和应用[J].世界农药，2013， 35（6）：7-11.

[9] 华乃震.含氟三唑类杀菌剂品种的论述[J].世界农药，2011，   33（4）：17-19.

[10] 何秀娟，徐育海，杨晓平.栗疫病病原菌致病性及生长特性研究[J].长江大学学报（自然科学版），2012，9（1）：1-4.

[11] 徐育海，何秀娟.湖北板栗品种对栗疫病抗性的鉴定与筛选[J]. 湖北农业科学，2013，52（24）：6060-6063.

[12] 王祥坤.嫁接板栗胴枯病病害调查与防治研究[J].安徽农业科学，2011，39（1）：211-213.

[13] 丁仕升，王祥坤，张忠良，等.板栗胴枯病病害调查与防治试验[J].西北林学院学报，2008，23（2）：118-120.endprint