微生物源杀菌剂先导化合物筛选研究

张志刚+杨自文+王开梅+张遵霞

摘要：以番茄早疫病菌（Alternaria solani）作为产孢病原菌的代表，进行了孢子浓度和培养时间对其敏感性影响的筛选试验;以小麦颖枯病菌（Septoria nodorum Berk）作为不产孢病原菌的代表，进行了菌丝碎片计数，同时比较了接菌浓度和培养时间对其敏感性影响的筛选试验;用两个杀菌剂标准样品进行了筛选稳定性比较试验，同时对576个微生物源提取物进行了筛选试验。结果表明，杀菌剂筛选必须控制接菌浓度和培养时间，从而保持适当的活性敏感度，才能得到稳定的筛选结果。适当降低接菌浓度和缩短培养时间可以提高活性样品的敏感度，有效的减少低活性样品的漏筛。

关键词：番茄早疫病菌（Alternaria solani）;小麦颖枯病菌（Septoria nodorum Berk）;先导化合物;杀菌活性;微生物源提取物

中图分类号：S482.4        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）23-5896-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.024

Studies on Screening of Lead Compounds of Fungicide from Microorganism

ZHANG Zhi-gang，YANG Zi-wen，WANG Kai-mei，ZHANG Zun-xia

（Hubei Biopesticide Engineering Research Center/The Branch Center of Biopesiticide， Hubei Agricultural Scientific and

Technological Innovation Center）

Abstract：One was Alternaria solani， which could produce a large number of spores in PDA medium. The other one was Septoria nodorum Berk， which couldn't produce spores in PDA medium. The sensitivity of screening results had been studied with different concentration of spores and infection time of A. solani. Homogenized the mycelia of S. nodorum Berk， and counted the number of mycelia fragments after filtration with Nylon net， and the sensitivity of screening had been studied with different concentration of mycelia fragments and infection time too. The two pathogenic fungus had been tested for their responses to 2 commercial fungicide standards， and had screened with 576 microbial extracts. The results showed that the stable screening results based on the appropriate sensitivity. The sensitivity affected by the appropriate inoculation concentration and incubation time of infection. Reduce the inoculation concentration and incubation time could improve sensitivity of screening， also could ensure that low active compounds would not be missed.

Key words：Alternaria solani;Septoria nodorum Berk;lead compound; fungicidal activity;microbial extract

为了提高筛选效率，杀菌剂先导化合物筛选不仅要有多个具有代表性的靶标，同时还要有高度敏感性，这与常规杀菌活性测定有很大差别。由于先导化合物在原材料中含量低、活性低，其对常规杀菌剂靶标无明显活性甚至不显示活性，因此先导化合物的筛选必须尽可能提高筛选靶标的敏感度，以增大具有潜在农药活性的先导化合物的发现机率。半固体法因其便于使用微孔板进行高通量筛选，常作为先导化合物筛选的首选方法。部分农业病原真菌在培养基上不产孢或产孢量少，因而只能用菌丝进行筛选，而菌丝的接种量难以定量，往往导致筛选结果不稳定。随着培养时间的增加，活性样品被加速消耗，同时真菌量还在加速增长。针对以上种种影响杀菌剂筛选稳定性的因素，本试验以番茄早疫病菌和小麦颖枯病菌为模式靶标，从接菌浓度、培养时间两方面对其敏感度的影响因素进行了筛选研究。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试菌种  番茄早疫病菌（Alternaria solani）和小麦颖枯病菌（Septoria nodorum Berk）由湖北省生物农药工程研究中心养虫室提供，试验用病原真菌菌种保存温度为-70 ℃，经过活化后，再扩大培养。放线菌和真菌发酵提取物由湖北省生物农药工程研究中心先导化合物研究室提供。endprint

1.1.2  仪器与试剂  仪器、设备主要有台式高速搅拌机（0-7 000 转/min）、血球计数板、光学显微镜、高压灭菌锅、超声波振荡器、电子移液器（MCE8k）、96孔组织培养板（深孔、浅孔）、人工气候箱（光、温可调）、无菌操作台。试剂主要有乙醇、吐温-80、PDA、PDB培养基，均为市售稳定生化试剂;杀菌剂标准样品有95%嘧菌酯（SIGMA-ALDRICH，C22H17N305）、98%咪鲜胺（SIGMA-ALDRICH，C15H16C13N302）;琼脂粉（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产，型号DH010-4）。

1.2  方法

1.2.1  供试病原真菌培养物准备  番茄早疫孢子悬浮液制备：取扩大培养3周后的纯培养物（直径9 cm培养皿），在培养皿中加入10 mL无菌水，用刮铲轻刮培养物表面，洗下孢子，制成孢子悬浮液。用细胞计数板进行孢子计数。其中混有部分菌丝，用灭菌的医用纱布将菌丝过滤掉。小麦颖枯病菌菌丝悬浮液制备：将扩大培养3周后的纯培养物（300 mL三角瓶，加入100 mL PDB培养），加入到高速搅拌机中，以5 000 r/min的速度搅拌2 min，经尼龙网过滤，滤液即为菌丝悬浮液。用细胞计数板进行碎菌丝计数。

1.2.2  番茄早疫病菌孢子接种浓度选择试验[1]  以标准PDB培养基为基础，加入0.7%琼脂配制成感染培养基。根据1.2.1中番茄早疫病菌孢子悬浮液中的孢子浓度，用感染培养基（接种温度55 ℃左右）进行稀释。孢子浓度分别稀释为10 000、5 000、2 500、1 250、625、312、156、78个/mL。接种后的培养基分装到96孔组织培养板（浅孔）中培养，每孔接入0.1 mL，温度20 ℃，相对湿度70%～80%，每天光照9 h，光照强度3 000 lx。每个浓度使用8个复孔。从第二天开始持续观察真菌生长情况。

1.2.3  小麦颖枯病菌碎菌丝接种浓度选择试验[2]  以标准PDB培养基为基础，加入0.7%琼脂配制成感染培养基。根据1.2.1中小麦颖枯病菌菌丝悬浮液浓度，用感染培养基（接种温度55 ℃左右）进行稀释。碎菌丝浓度分别稀释为100 000、50 000、25 000、12 500、6 250、3 120、1 560、780个/mL。接种后的培养基分装到96孔组织培养板（浅孔）中培养，每孔接入0.1 mL。培养条件为温度20 ℃，相对湿度70%～80%，每天光照9 h，光照强度3 000 lx。每个浓度使用8个复孔。从第二天开始持续观察真菌生长情况。

1.2.4  番茄早疫病菌对杀菌剂的敏感性试验[3]

1）杀菌活性评价指标。根据杀菌活性反应的不同，使用分级指标数（0、3、5、7、9）标记杀菌活性[4]。

2）把两个标准品配制成母液，浓度为0.2 mg/mL，以含0.05% TW-80的无菌水稀释成12个不同的浓度梯度。组织培养板中感染培养基加入量为0.09 mL/孔，样品稀释液加入量为0.01 mL/孔。每个浓度设4个重复。重复试验3次。培养条件为：温度20 ℃，相对湿度70%～80%，每天光照9 h，光照强度3 000 lx。从第二天开始检查并记录结果，计算LC50的平均值。

1.2.5  番茄早疫病菌和小麦颖枯病菌的不同接菌浓度对微生物源提取物的敏感性试验[5]  随机选择6批微生物提取物，每批提取物96个样品，共576个提取物。把提取物配制成母液，浓度为4 mg/mL。以含0.05%TW-80的无菌水稀释到0.8 mg/mL。组织培养板中感染培养基加入量为0.09 mL/孔，提取物样品稀释液加入量为0.01 mL/孔。提取物终浓度为0.08 mg/mL。每个样品用一个浓度，设3个重复。培养条件为：温度20 ℃，相对湿度70%～80%，每天光照9 h，光照强度3 000 lx。从第二天开始检查并记录活性率。

2  结果与分析

2.1  番茄早疫病菌孢子接种浓度的选择结果

每个浓度使用8个复孔，观察各孔中菌丝生长情况，累计菌丝长满整个培养基的孔数。第五天后菌丝过度生长，开始向周围孔扩散生长，此时停止继续观察。为了便于比较活性情况，理想的孢子接种量应该是在菌丝过度生长前，阴性对照组的菌丝刚刚长满或者接近长满时。结果（表1）显示，孢子接种量为625 和1 250 个/mL时，接近理想接种量。综合菌丝过度生长的时限，把感染培养时间定为4 d，孢子接种量定为1 000 个/mL。

2.2  小麦颖枯病菌碎菌丝接种浓度的选择结果

每个浓度使用8个复孔，观察各孔中菌丝生长情况，累计菌丝长满整个培养基的孔数。第七天后组织培养板周边孔内培养基开始失水干裂，所以停止继续观察。为了便于比较活性情况，理想的接种量应该是在菌丝过度生长前，阴性对照组的菌丝刚刚长满或者接近长满时。结果（表2）显示，碎菌丝接种量在25 000 个/mL和50 000 个/mL时，接近理想接种量。综合菌丝过度生长的时限，我们把感染培养时间定为4 d，接种量定为30 000 个/mL。

2.3  番茄早疫病菌对杀菌剂敏感性的试验效果

根据2.1的试验结果，感染培养基中孢子最终浓度为1 000 个/mL。表3显示，随着培养时间的延长，嘧菌酯对番茄早疫病菌的LC50快速增大，说明番茄早疫病菌敏感性逐步降低;而咪鲜胺对番茄早疫病菌的LC50缓慢增大，第五天的LC50仅是第二天的两倍;并且番茄早疫对两种杀菌剂在相同培养时间的敏感性差别较大。

2.4  番茄早疫病菌和小麦颖枯病菌的不同接菌量对微生物源提取物敏感性试验结果endprint

根据2.1和2.2的试验结果，感染培养基中番茄早疫病菌孢子的终浓度设为两个，分别为10 000 个/mL和1 000 个/mL;小麦颖枯病菌菌丝碎片终浓度分别为100 000 个/mL和30 000个/mL。分别加入提取物样品，培养4 h后，统计活性样品检出率。表4显示，番茄早疫病菌接种孢子量从10 000个/mL降低到1 000 个/mL时，活性样品检出率提高到原来的2倍;小麦颖枯病菌接种碎菌丝量从100 000个/mL降低到30 000个/mL时，活性样品检出率提高到原来的3倍。可见降低接菌量可以提高筛选的敏感度。

3  小结与讨论

杀菌剂标准样品对番茄早疫病菌和小麦颖枯病菌的活性试验结果表明，不同病原真菌在筛选中的适宜接种量有较大差异，杀菌活性与供试真菌的接种量和培养时间均呈负相关。应用微生物源提取物进行的筛选试验也验证了这一结论。由于农业病原真菌种类多，杀菌剂先导化合物筛选必须选择多个模式病原菌进行筛选，才能有效地利用样品资源[6]。使用半固体培养基法作为初筛方法，可以提高筛选能量，但存在活性不稳定的问题，特别是在人工培养基中很难产生孢子的靶标，其菌丝常常相互交织在一起，无法定量接种。通过切断菌丝，并过滤，可以获得长度相近的菌丝段，进而实行菌丝定量接种。在菌丝计数前，培养物在高速转动的刀片作用下，升温比较快。同时由于菌丝被切断时引起的损伤，会使部分碎菌丝失去活力，因此必须控制单次搅拌时间，防止培养物在短时间内升温过快。由于病原菌对样品的敏感特异性、接种量、培养时间引起筛选活性样品检出率不同，在实际应用中，有必要针对每一个病原真菌，使用适合的接菌量和培养时间。考虑到活性检出率过高会增加后续色谱分析和组分杀菌活性定量分析的工作量，在实际筛选中，把多个靶标的活性样品检出率总比例控制在15%以下比较合适。

参考文献：

[1] 梁伟伶，台莲梅，靳学慧，等.马铃薯早疫病菌室内杀菌剂筛选及配比试验[J].植物保护，2009，35（4）：168-171.

[2] 冯俊涛，石勇强，张  兴.56种植物抑菌活性筛选试验[J].西北农业科技大学学报（自然科学版），2001，29（2）：65-68.

[3] 王文桥，韩秀英，张小风，等.防治小麦纹枯病的杀菌剂筛选[J].华北农学报，2007，22（增刊）：230-234.

[4] 张志刚，杨自文，王开梅，等.除草剂组合靶标筛选的研究[J].湖北农业科学，2013，52（23）：5757-5759，5810.

[5] 于淑晶，边  强，王满意，等.高通量筛选技术在农用杀菌剂创制研究中的应用[J].农药，2012，51（8）：550-553，564.

[6] 邱立红，张文吉，王成菊，等.高通量筛选在新农药创制研究中的应用[J].农药科学与管理，2002，23（5）：20-24，32.endprint