蒙药额日敦乌日勒对大鼠周围神经损伤早期c-fos表达及神经功能的影响

蒙药额日敦乌日勒对大鼠周围神经损伤早期c-fos表达及神经功能的影响

额尔敦朝鲁，包春生，周铁宝，赵福全，胡玉荣，李立

(内蒙古民族大学附属医院，内蒙古 通辽 028007)

摘要：目的观察额日敦乌日勒对大鼠坐骨神经损伤早期c-fos表达及神经功能的影响，探讨其疗效及作用机理。方法将64只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组、额日敦乌日勒组。除了假手术组外建立坐骨神经夹持损伤模型，阳性对照组大鼠每日给予维生素B1和维生素B12各3 mg/kg、10 μg/kg；额日敦乌日勒组大鼠每日给予额日敦乌日勒0．3 g/kg，灌胃体积均为2 mL/100 g，观察造模后1周、4周每组大鼠坐骨神经功能指数(SFI)、神经传导速度(NCV)及坐骨神经中c-fos表达变化。结果治疗1周后，假手术组、阳性对照组、额日敦乌日勒组SFI值较模型组差异有统计学意义(P<0．05),且额日敦乌日勒组优于阳性对照组 (P<0．05) ；额日敦乌日勒组、阳性对照组与模型组比较，NCV值有所上升(P<0．05)；额日敦乌日勒组、阳性对照组与模型组比较，c-fos蛋白表达灰度值均明显增高(P<0．05)。治疗4周后，模型组、假手术组、阳性对照组、额日敦乌日勒组SFI值差异无统计学意义(P> 0．01)，额日敦乌日勒组、阳性对照组与模型组比较，NCV值明显提高(P<0．05)；额日敦乌日勒组、阳性对照组与模型组比较,c-fos蛋白表达灰度值均明显增高(P<0．05)。结论额日敦乌日勒对周围神经损伤有一定的疗效，其作用机制可能是通过抑制c-fos表达,从而起到促进坐骨神经感觉和运动功能恢复的作用。

关键词：额日敦乌日勒；坐骨神经损伤；坐骨神经功能指数；免疫组化；c-fos蛋白

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.11.022

中图分类号：R722.14文献标志码： A

基金项目：内蒙古自治区卫生厅项目(2005061)。

作者简介：额尔敦朝鲁(1963-)，男,医学硕士，教授，主任医师，主要从事神经系统感染免疫性疾病研究。

收稿日期:(责任编辑：张瑞彬2014-11-14)

Erdunwurile on C-fos expression and nerve function of early peripheral nerve injury in rats

Eerdunchaolu, BAO Chunsheng, ZHOU Tiebao, ZHAO Fuquan, HU Yurong, LI Li

(Affiliated Hospital of Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao 028007,

Inner Mongolia Autonomous Region,China)

Abstract：ObjectiveThe effects of Eridunwurile on c-fos expression and the neural function of Early stage following sciatic nerve injury in rats are observed through experiments, to explore the effects and mechanism of it. MethodsThe 64 SD rats were randomly divided into sham-operated group,model group, positive control group and Eridunwurile group. In addition to sham-operated group was established sciatic nerve injury model,positive control group's rats was given 3 mg/kg,10 μg/kg of vitamin B1,and vitamin B12;Erdunwurile group’s rats was given 0.3 g/kg,2 mL/100 g.At 1st and 4th weeks after treatment, 8 rats from each group detected sciatic nerve function index(SFI), and nerve conduction velocity (NCV) and grey value of c-fos positive expression. ResultsSFI: At 1st week after treatment, the recovery of Eridunwurile low-dose group, Eridunwurile high-dose group and positive control group was obviously superior to the model group,there is statistically significant (P<0．05); Eridunwurile low-dose group was significantly different from positive control group (P<0．05). TWL: At 1st week after treatment, compared with model group, TWL of Eridunwurile low-dose group were significantly prolonged. (P<0．05). NCV: At 1th and 4th weeks after treatment, compared with the model group, the NCV of Eridunwurile low-dose group and positive control group were obviously accelerated(P<0．05). After 4 weeks treatment Model group, control group, positive control group, the forehead, SFI value, le group no significant statistically(P> 0．01), Grey value of C-FOS positive expression：At 1st and 4th weeks after treatment, Gray value of Eridunwurile low-dose group, Eridunwurile high-dose group and positive control group was significantly higher than the model group (P<0．05); Gray value of Eridunwurile low-dose group was significantly higher than the positive control group(P<0．05). ConclusionErdunwurle to be effective treat sciatic nerve injury in rats, its mechanism is improve the conductive function, analgesia and recovery of sciatic nerve functional by inhibited c-fos expression.

Keywords：Eridunwurile;sciatic nerve injury; thermal withdrawal latency;sciatic nerve cduction velocity;c-fos protein

周围神经损伤是因直接或间接因素(如外伤、感染、免疫、代谢障碍等)引起神经干或其分支损伤而导致神经功能缺失。周围神经损伤再修复是一个复杂的过程，研究表明c-fos 表达参与轴突对伤害性刺激的反应，对神经受到外界刺激后能够迅速作出反应而进行表达[1]。蒙药额日敦乌日勒治疗周围神经损伤疗效确切，具有清毒热、杀粘疫、开窍、调理体质、清血热等功效，前期研究已证实额日敦乌日勒对坐骨神经损伤后的修复及神经功能的恢复具有明显的促进作用[2]。本研究观察药物干预下坐骨神经中c-fos表达变化，为蒙药治疗周围神经损伤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组实验动物采用SD大鼠64只，体质量170～230 g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号:SCXK(北京)2006-0009。应用EXCEL软件将动物按体质量随机分组，分为假手术组、模型组、阳性对照组、额日敦乌日勒组等4组，每组16只。

1.2模型制作大鼠称重后，用新配制的10%水合氯醛 (10 mL/kg)腹腔注射麻醉，剪去手术区域的毛，俯卧位固定在自制的鼠板上，并消毒手术区域。消毒完后于右股骨后外侧纵行切口，钝性分离肌肉组织，暴露坐骨神经，用特制的止血钳挤压坐骨神经(扣到止血钳的第一扣)10 s后松解止血钳并关闭切口，注射青霉素0．15×106U/(kg·d)防止感染。假手术组仅暴露坐骨神经，不造模。术后观察各组大鼠一般情况。

1.3处理方法额日敦乌日勒组灌胃额日敦乌日勒0．3 g/kg，阳性对照组灌胃维生素B13 mg/kg+维生素B1210 μg/kg，灌胃体积为2 mL/100 g， 2次/d灌胃，连续灌胃4周。假手术组和模型组灌胃同体积蒸馏水。

1.4标本制作分别在造模1周、4周时，将各组大鼠随机选取8只，用10%水合氯醛 (10 mL/kg)腹腔注射麻醉，将含有4%多聚甲醛溶液和0．9%氯化钠溶液的灌注针插入左心室，打开灌流器用0．9%氯化钠溶液进行灌注，同时剪开右心耳，当肝脏发白时将其关闭，打开含有4%多聚甲醛溶液进行灌注，待大鼠全身变硬后结束灌注。剪开大鼠右侧臀股交界处皮肤，钝性分离肌肉、筋膜等组织，取出损伤区1 cm的坐骨神经。

1.5行为学检测自制长59．5 cm、宽10 cm、高10 cm的大鼠行走箱，箱底铺一张标记好的白纸后将大鼠双侧后肢沾上墨水放进行走箱内。将印有大鼠双后肢足印的白纸取出后选取最清楚的足印，用0．02 mm精度的游标卡尺测量双后肢1～5、2～4足趾的间距和足印长度。用Bain[3-4]公式计算SFI。

1.6免疫组化检测分别在1周、4周时，各组取8只大鼠坐骨神经置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h。常规脱水透明后石蜡包埋组织，切4 μm厚的切片。用SP免疫组化染色方法检测坐骨神经干中c-fos蛋白的表达情况。在200倍镜下每张切片连续选取5个视野进行灰度值测定，并取其平均值。

2结果

2.1坐骨神经功能指数(SFI)检测治疗1周后，与假手术组比较其他3组SFI均明显降低 (P<0.05) ；与模型组比较，额日敦乌日勒组和阳性对照组SFI恢复明显优于模型组(P<0．05) ；额日敦乌日勒组优于阳性对照组(P<0．05)。治疗4周后，各组大鼠坐骨神经功能基本恢复正常，各组间差异无统计学意义(P>0．05)。见表1。

表1　各组SFI结果比较

注：与假手术组比较，#P<0．05；与模型组比较，△P<0．05；与阳性对照组比较，▲P<0．05

2.2坐骨神经传导速度(NCV)检测治疗1周，与假手术组比较，模型组和阳性对照组NCV明显减慢(P<0．05)；与模型组比较，额日敦乌日勒组NCV明显加快 (P<0．05) ；与阳性对照组比较，额日敦乌日勒组NCV明显加快 (P<0．05)。治疗4周，与假手术组比较，模型组和阳性对照组NCV明显减慢 (P<0．05)；与模型组比较，额日敦乌日勒组NCV明显加快 (P<0．05)；与阳性对照组比较，额日敦乌日勒组NCV也明显加快(P<0．05)。见表2。

表2　各组NCV结果比较

注：与假手术组比较，##P<0．01；与模型组比较，△△P<0．01；与阳性对照组比较，▲P<0．05

2.3免疫组化检测治疗1周后，与假手术组比较，额日敦乌日勒组差异无统计学意义(P>0．05)，而其他2组灰度值明显降低(P<0．05)；与模型组比较，额日敦乌日勒组和阳性对照组灰度值明显增高(P<0．05)；与阳性对照组比较，额日敦乌日勒组灰度值也明显增高(P<0．05)。治疗4周后，各组间的比较与造模1周相同。见表3，图1、图2。

表3　各组坐骨神经c-fos表达灰度值比较 ± s)

注：与假手术组比较，#P<0．05；与模型组比较，△P<0．05；与阳性对照组比较，▲P<0．05

(400倍，A：假手术组，B：模型组，C：阳性对照组，D：额日敦乌日组) 图1　治疗1周后c-fos免疫组化结果

(400倍，A：假手术组，B：模型组，C：阳性对照组，D：额日敦乌日组) 图2　治疗4周后c-fos免疫组化结果

3讨论

周围神经通过神经元将信息沿着感觉和运动纤维传递，参与躯体与内脏的运动、感觉和植物功能调节[5]。体内外环境发生剧烈变化时可使其受到损伤，神经损伤段的近、远端出现一系列复杂的病理生理变化，其神经元及微环境发生改变，从而发生运动和感觉功能的障碍[6]。c-fos作为在原癌基因家族中快速反应基因，参与神经纤维对伤害性刺激的反应，启动c-fos的靶基因使NGFmRNA 转录增加，促进NGF的合成，从而促进损伤神经的修复[1]。

本实验研究结果表明，治疗1周后，额日敦乌日勒组、阳性对照组与模型组比较，SFI值高于模型组(P<0．05)；额日敦乌日勒组、阳性对照组与模型组比较，NCV值有所上升(P<0．05)；额日敦乌日勒组、阳性对照组与模型组比较，c-fos蛋白表达灰度值均明显增高(P<0．05)。治疗4周后，模型组、假手术组、阳性对照组、额日敦乌日勒组SFI值无显著差异(P>0．01)；额日敦乌日勒组、阳性对照组与模型组比较，NCV值明显提高(P<0．05)；额日敦乌日勒组、阳性对照组与模型组比较，c-fos蛋白表达灰度值均明显增高(P<0．05)，表明额日敦乌日勒具有抑制c-fos蛋白表达的作用，从而促进损伤神经的修复，提高神经传导速度，促进坐骨神经损伤大鼠运动功能的恢复。

参考文献：

[1] NARITA M, OZAKI S, NARITA M, et al Change in the expression of c-fos in the rat brain following sciatic nerve legation [ J] . Neu rosci Lett, 2003, 352: 231.

[2] 乌查日拉图,喜杰.蒙药珍宝丸对大鼠坐骨神经挤压损伤的修复作用研究[J].中国民族医药杂志,2011,4(4):48-50.

[3] BAIN J R, MACKINNON S E, HUNTER D A. Functional evaluation of complete sciatic, peroneal and posterior tibial nerve lesions in the rat[J]. Plast Reconstrsurg, 1989, 83(1): 129.

MN-DE LA GARZA.Celecoxib accelerates functional recovery after sciatic nerve crush in the rat[J].Journal of Brachial Plexus and Peripheral Nerve Injury ,2008,3:25.

[5] 张立新,佟晓杰,贾桦,等.超短波对大鼠周围神经缺损修复术后神经再生的影响[J].中国康复医学杂志,2009,24(8):695-698.

[6] TOM V J,SANDROW-FEINBERG H R,MILLER K,et al.Combining peripheral nerve grafts and chondroitinase promotes functional axonal regeneration in the chronically injured spinal cord[J].J Neurosis,2009,29(47):14881-14890.