山核桃饼粕蛋白提取工艺的优化

刘双凤 王华生

（湖南省农林工业勘察设计研究总院，湖南 长沙 410007）

山核桃（Carya cathayensis Sarg.）是胡桃科山核桃属植物，主要分布在浙、皖两省交界的天目山一带，是中国特产的优良干果、油料树种［1，2］。目前，山核桃大部分被用于油脂榨取，压榨后的饼粕基本被直接丢弃［3］。研究［4，5］发现，山核桃饼粕中约含有20%的蛋白质，其蛋白的效价与动物蛋白相近，含有多种人体必需氨基酸，尤其是精氨酸、谷氨酸、组氨酸、酪氨酸的含量非常高，且必需氨基酸的含量比例合理，接近联合国粮农组织和世界卫生组织规定的标准氨基酸配比，具有很高的食用价值和保健功能。

目前用于蛋白提取的方法主要有十六烷基三甲基溴化铵法、尿素法、脂肪酸盐法、碱提酸沉法等［6］，其中碱提酸沉法因为操作简单、提取率高，被广泛应用于实际生产中［7］，其在山核桃饼粕上的应用也倍受关注。赵见军等［8］曾对核桃粕中蛋白的提取工艺进行优化，但其采用的超声波辅助浸提法，由于设备的限制离实际生产应用还有一定距离。杨瑾等［9］曾优化了碱提酸沉法提取山核桃饼粕的工艺，但其是以冷冻干燥后的粗蛋白为评价指标，有失偏颇。

本课题汲取前人［8，9］的研究经验并做适当调整，以山核桃为原料，借助二次正交旋转组合试验设计，对碱提酸沉法提取山核桃饼粕蛋白工艺进行优化，以期为山核桃资源的充分利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷榨山核桃饼粕：河北黄金龙食用油有限公司；

牛血清白蛋白：≥98.5%，上海金穗生物科技有限公司；

石油醚（60～90℃）、氢氧化钠、盐酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器设备

摇摆式粉碎机：DFY－500D型，温岭市林大机械有限公司；

智能型蒸馏器：HR－1000型，上海华睿仪器有限公司；

数显定时消化炉：HR－08型，上海华睿仪器有限公司；

台式高速离心机：TG16－WS型，湖南湘仪科学设备有限公司；

数显恒温水浴锅：HH－8型，江苏省金坛市环宇科学仪器厂；

冷冻干燥机：FD－2A型，上海争巧科学仪器有限公司；

台式精密酸度计：TP310型，上海雷磁新泾仪器有限公司；

可见分光光度计：722N型，上海圣科仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

山核桃饼粕→粉碎（过30目筛）→干燥（50℃，24h）→脱脂（索氏抽提8h）→调至碱性（NaOH）→恒温浸提→离心（3 000r/min，20min）→上清液→调至酸性（HCl）→离心（3 000r/min，20min）→沉淀→洗至中性（蒸馏水）→真空冷冻干燥（－10℃预冻12h，－30℃干燥24h）→山核桃蛋白

1.3.2 山核桃饼粕蛋白等电点的测定 准确称取山核桃饼粕20.0g于烧杯中，按料液比1∶15（m∶V）加入蒸馏水，用1mol/L的NaOH溶液调节体系pH至9.0，于50℃的恒温水浴锅内浸提120min。浸提完成后，3 000r/min离心20min，获取上清液。取1mL待测液（将1mL的提取上清液定容至100.0mL）用分光光度计测吸光度值（在595nm波长下），并根据标准曲线（详见1.3.6）计算出蛋白质含量；另取7份15mL的上清液，以1mol/L的HCl溶液调节体系pH 分别为 3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，分别离心（3 000r/min，20min）并取1mL稀释了100倍的上清液用可见分光光度计测吸光度值（在595nm波长下），根据标准曲线（详见1.3.6）计算出蛋白质含量。以式（1）计算山核桃饼粕蛋白质的沉淀率，最大时的pH值即为其等电点。

式中：

R1——山核桃蛋白质的沉淀率，%；

m1——酸沉前的蛋白质含量，mg/mL；

m2——酸沉后的蛋白质含量，mg/mL。

1.3.3 单因素试验设计

（1）提取时间：在提取温度为50℃、料液比为1∶15（m∶V）、pH 为9.0的条件下，考察提取时间（30，60，90，120，150，180min）对山核桃饼粕蛋白提取率的影响。

（2）提取温度：在提取时间为120min、料液比为1∶15（m∶V）、pH 为9.0的条件下，考察提取温度（40，45，50，55，60，65℃）对山核桃饼粕蛋白提取率的影响。

（3）料液比：在提取时间为120min、提取温度为55℃、pH为9.0的条件下，考察料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，m∶V）对山核桃饼粕蛋白提取率的影响。

（4）pH值：在提取时间为120min、提取温度为55℃、料液比为1∶20（m∶V）的条件下，考察pH（8，9，10，11，12）山核桃饼粕蛋白提取率的影响。

1.3.4 二次正交旋转组合优化试验 根据单因素试验的结果，并考虑到TP310型台式精密酸度计灵敏度的实际情况，固定浸提的pH为9.0不变，以提取时间、提取温度、料液比为试验因素，山核桃粕蛋白提取率为响应值，采用二次正交旋转组合试验设计对提取工艺进行优化。

1.3.5 山核桃饼粕中蛋白质含量的测定 按GB 5009.5—2010执行。

1.3.6 上清液中蛋白含量的测定 采用考马斯亮蓝法。

（1）绘制标准曲线：参照文献［10］的方法，以蛋白质含量（X，mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线得线性回归方程A＝4.951 4X－0.013 5（R2＝0.998）。

（2）对样品的测定：将离心分离后的山核桃饼粕蛋白提取液定容至100mL，静置后取出1mL稀释100倍待测。测定时，取待测液1mL参照文献［10］测吸光度A值，并计算蛋白含量。

1.3.7 蛋白质提取率的测定 蛋白质提取率按式（2）计算：

式中：

R2——蛋白沉淀率，%。

m3——上清液蛋白含量，mg/mL；

m4——脱脂后山核桃饼粕中的蛋白含量，mg/mL。

1.4 数据处理

每次试验重复3次，结果以珚x±s表示。运用SPSS 17.0进行统计分析，显著水平取P＜0.05（差异显著）；借助DPS 7.05进行二次正交旋转组合优化试验。

2 结果与分析

2.1 山核桃饼粕蛋白等电点分析

由图1可知，在浸提液pH为3.0～6.0时，随着pH的增加，蛋白的沉淀率呈先增后减的趋势，在pH为5.0时，沉淀率最大（P＜0.05）。这与文献［8］报道的当pH 值在5.0时蛋白质沉淀迅速，离心后上清液清亮，效果较好的情况一致，故山核桃蛋白的等电点是pI为5.0。

图1 pH对蛋白沉淀率的影响Figure 1 Ettects of pH values on protein deposition rate

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取时间对山核桃饼粕蛋白质提取率的影响 由图2可知，随着提取时间的延长，山核桃饼粕蛋白的提取率逐渐增加；当提取时间为120min时，蛋白的提取率增幅趋于平缓（与150min时没有显著性差异，P＞0.05）。故提取时间宜控制在120min左右。

图2 提取时间对提取率的影响Figure 2 Ettects of different extraction time on protein yield

2.2.2 提取温度对山核桃饼粕蛋白提取率的影响 由图3可知，随着提取温度的升高，蛋白质提取率呈先增后减的趋势，当提取温度为55℃时提取率达到最大值（P＜0.05）。可能与蛋白质分子构象随着提取温度的升高而发生改变有关，提取温度的升高，促进了山核桃蛋白立体结构的伸展，使其在水分子的热运动下更易溶解［11］；当提取温度过高时，使得维持蛋白质空间构象的次级键断裂，天然构象解体，蛋白变性，提取率降低［12］。故提取温度宜控制在55℃左右。

图3 提取温度对提取率的影响Figure 3 Ettects of different extraction temperature on protein yield

2.2.3 料液比对山核桃饼粕蛋白提取率的影响 由图4可知，当料液比≤1∶20（m∶V）时，蛋白提取率随其增大而增加（P＜0.05），之后趋于稳定。可能是在较低料液比时，由于溶液的黏度较大，分子扩散速率较低，体系分散不均匀，导致体系中的蛋白溶出困难；随着液料比的增大，蛋白质更易溶出，因而提取率增加，直至其完全浸出，体系保持动态平衡，提取率不再改变［13］。故料液比宜控制在1∶20（m∶V）左右。

图4 料液比对提取率的影响Figure 4 Ettects of different extraction solid－liquid ratio on protein yield

2.2.4 pH值对山核桃饼粕蛋白质提取率的影响 由图5可知，当pH值为9.0时蛋白提取率最高（P＜0.05），过高或者过低的pH值都不利于蛋白的提取。可能是蛋白的基本结构中含有氨基和羧基两种官能团，不同的pH环境会影响其存在的方式，进而改变溶出效果。并考虑到TP310型台式精密酸度计灵敏度的实际情况，确定后续试验提取液的pH 值为9.0。

图5 pH值对提取率的影响Figure 5 Ettects of different extraction pH on protein yield

2.3 二次正交旋转组合试验结果

二次正交旋转组合设计的因素水平安排及试验结果分别见表1、2。

表1 二次正交旋转组合设计因素水平表Table 1 Factors and code levels of quadratic orthogonal rotation combination design

表2 二次正交旋转组合试验结果Table 2 The test results of quadratic orthogonalrotation combination design

对试验结果进行拟合得到回归方程：

由表3可知，回归方程的失拟性检验F1＝2.598 20＜F0.01（5，8）＝3.69不显著（P＝0.076 8＞0.05），说明所选的二次回归模型适当；回归显著性检验F2＝6.253 04＞F0.01（9，13）＝4.17极显著（P＝0.004 7＜0.01），说明模型的预测值与实测值接近，模型成立［9］。在α＝0.10显著水平剔除不显著项后，得到简化后的回归方程：

由式（4）的各项系数可知，对山核桃饼粕蛋白提取率影响较大的因素依次为X1（提取时间）＞X3（料液比）＞X2（提取温度），且这3因素之间不存在差异显著性（P＜0.05）的两两交互作用，故未列出等高线及交互作用图。

由表4可知，在95%的置信区间内当提取时间为124～130min，提取温度为53～57℃，料液比为1∶22～1∶26（m∶V），pH值9.0时，山核桃蛋白的提取率较高。为节约生产成本，在实际应用中选定各因素的最低值，即提取时间124min，提取温度53℃，料液比1∶22（m∶V），并进行5次验证实验，其山核桃蛋白的平均提取率为（67.94±0.05）%，与预测最高值67.98%不存在显著性差异（P＜0.05），说明拟合所得的回归方程能较好地指导山核桃蛋白的提取。

表3 试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of test results

表4 各因素的频率分布Table 4 The probability distribution of values of each variable

3 结论

（1）山核桃蛋白的等点电为pI 5.0，这与文献［6］报道的（pI 4.5～5.5）结果相近，但在该等电点下的最大沉淀率仅为89.8%，要低于文献［6］报道的94.5%，可能是试验原料及蛋白质检测方法的差异造成的。由于本试验选用的考马斯亮蓝法极易受到样品中多糖等成分的干扰，所以其检测线性范围和结果的准确性均比文献［8］所用的双缩脲法差，下一步将针对此进行对比试验，以明确山核桃蛋白的等电点。

（2）山核桃蛋白的最佳提取条件为：pH 9.0，提取时间124min，提取温度53℃，料液比1∶22（m∶V），在该条件山核桃饼粕蛋白的平均提取率为（67.94±0.05）%，与预测的最高值67.98%不存在显著性差异（P＜0.05）。考虑到考马斯亮蓝法仅能检测水溶性蛋白［14］，故推测山核桃中的实际蛋白含量要高于该值，未来将借助于液相色谱等技术对其进行精确测定。

1 陈向明，李军，唐龙华，等.山核桃外果皮制备焦磷酸钾工艺条件的筛选［J］.经济林研究，2008，26（3）：47～52.

2 欧阳韶晖，李春娟，罗勤贵.水代法提取核桃油后蛋白粕溶解乳化特性研究［J］.中国粮油学报，2008，23（2）：99～101.

3 钟海雁，李忠海，袁列江，等.核桃生产加工利用研究的现状与前景［J］.食品与机械，2002（4）：4～6.

4 Szetao K W C，Sathe S K.Walnut（Juglans regia L.）proximate composition，protein solubility，protein aminoacid composition and protein in vitro digestibility ［J］.Sci.Food Agric.，2000（80）：1 393～1 401.

5 刘淼.核桃仁水剂法取油工艺及核桃乳的研究［D］.无锡：江南大学，2004.

6 张凯，吴卫国.大米蛋白提取工艺研究进展［J］.粮食加工，2010，35（3）：38～40.

7 吕飞，许宙，程云辉.米糠蛋白提取及其应用研究进展展［J］.食品与机械，2014，30（3）：234～237.

8 赵见军，张润光，马玉娟，等.核桃粕中蛋白提取工艺的优化［J］.食品科学，2014，35（18）：40～46.

9 杨瑾，董明，曹彬彬，等.山核桃饼粕分离蛋白的提取工艺研究［J］.食品工业科技，2012，40（5）：280～283.

10 李加兴，房惠芳，陈选，等.牡丹籽粕蛋白提取工艺优化及其等电点分析［J］.食品与机械，2014，30（3）：147～149.

11 赵玉红，李莉.超声波辅助提取松仁蛋白的工艺研究［J］.中国林副特产，2008（1）：6～8.

12 潘晶，张晖，王立，等.棉籽蛋白两步法提取及其功能性质研究［J］.中国油脂，2010，35（7）：19～23.

13 彭永健，张安强，马新，等.玉竹多糖超声提取工艺优化及其保湿性研究［J］.食品科学，2012，33（14）：96～99.

14 孙蓉，吴文标.食品中蛋白质检测技术研究进展［J］.食品科学，2012，33（23）：393～397.