桉叶多酚连续相变提取工艺的优化

谭荣威 曹 庸 利嘉城

（华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）

桉树（Eucalyptus robusta Smith）主要分布于亚洲、非洲和中南美洲的热带、亚热带地区，具有生长快、适应能力强等特点。于1890年引入中国，迄今已在广西、四川和广东等17个省（区）种植［1］。2013年，中国桉树人工林面积约450万hm2，桉树叶产量超过2 000万t［2］。研究［3－6］表明：桉树叶中含有多酚、精油等活性成分。其中，多酚是桉树叶中含量较高且抗氧化性强的一类天然活性物质，其DPPH·清除率高于多酚含量为50%的茶多酚，与Vc相当［7－10］。但目前，只有少部分桉树叶用于精油提取，资源未得到充分利用。

目前用于植物多酚提取的方法主要有溶剂浸提法、微波、超声波辅助萃取和超临界萃取等［11］。本实验室［7］前期研究发现，运用溶剂浸提法提取桉叶，其多酚提取量为9.0～9.5g/100g，该法提取效率较低。同时，溶剂浸提法、微波和超声波辅助萃取还存在提取后过滤困难，提取溶剂回收不便等问题。超临界萃取法其设备制造成本和维护成本过高，且极高的压力限制了设备容积的放大。连续相变提取装置是一种新型高效流体提取装置［12－14］。利用提取溶剂的反复相变，稳定、高效地连续萃取目标物。该方法较溶剂浸提法提取效率高，溶剂回收方便，损失率低，粗提取液无需过滤，本实验室利用该装置已经完成了多种天然活性物的中试提取生产，如陈皮油等［15］，已有产品在售。本试验拟用连续相变提取装置提取桉叶多酚，探究提取温度、提取时间、乙醇浓度对桉叶多酚提取量的影响，并通过响应面法优化分析，对相关工艺进行优化，从而为桉叶多酚后续的应用效果评价提供技术支持，推动桉叶废物再利用的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

桉树叶：“广林9号”桉树叶，2013年9月采自广东茂名；

乙醇：分析纯，天津富宇精细化工有限公司；

Na2CO3：化学纯，天津市福晨化学试剂厂；

福林—酚、没食子酸标准品：生化试剂，美国Sigma－Aldrich公司。

1.1.2 主要仪器设备

连续相变提取装置：本实验室自制；

紫外可见分光光谱仪：SKFG－0型，美国Pharmarcia Biotech公司；

旋转蒸发器：R204B3型，上海申生科技有限公司；

超声波清洗器：B1510型，美国Bransonic公司；

喷雾干燥仪器：HL－2000型，湖南海陵生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 桉叶粗提物的制备 称取自然阴干，过20～30目筛的桉叶粉末700g，装入连续相变提取装置，设定一定温度、乙醇浓度进行连续提取若干时间。取醇提液喷雾干燥（进风温度180℃，出风温度80℃，雾化器转速12 000r/min，供料泵流量4L/h），即得桉叶粗提物。4℃，密封状态下避光保存。

1.2.2 多酚提取量的测定 参照文献［7］测定桉叶粗提物的多酚含量，并按式（1）计算多酚提取量。

式中：

R——桉叶多酚提取量，g/100g；

m——桉叶粗提物质量，g；

M——待提取的桉叶质量，g；

C——桉叶粗提物中多酚含量，mg/g。

1.2.3 单因素试验设计 在连续相变提取装置中，提取温度、提取时间、溶剂溶度和提取压力是影响目标物提取率的主要因素。根据前期试验探索及汤杰［16］的研究结果，本试验分别选取提取温度、提取时间、溶剂溶度为试验单因素进行研究。每个水平重复试验3次。

（1）提取温度对多酚提取量的影响：称取自然阴干，过20～30目筛的桉叶粉末约700g，装入提取釜中，在溶剂为80%乙醇的条件下，分设30，40，50，60，70，80℃共6个温度梯度，提取时间为30min。提取液经喷雾干燥成粉后，保存备用，待多酚含量测定，并计算桉叶多酚提取量。

（2）乙醇浓度对多酚提取量的影响：称取自然阴干，过20～30目筛的桉叶粉末约700g，装入提取釜中，在60℃下分设40%，60%，70%，80%，95%共5个乙醇浓度梯度，提取时间为30min。后续步骤同1.2.3（1）。

（3）提取时间对多酚提取量的影响：称取自然阴干，过20～30目筛的桉叶粉末约700g，装入提取釜中，在60℃，80%乙醇为溶剂的条件下，分设20，30，50，70，100，120min共6个提取时间梯度进行提取。后续步骤同1.2.3（1）。

1.2.4 响应面试验设计 根据单因素试验结果，以桉叶多酚提取量为衡量指标，通过Box－Benhnken中心组合法来进行试验设计，寻求桉叶多酚的最佳提取条件。

1.2.5 数据处理 使用SPSS 19.0对数据进行统计分析，数据以平均值±标准差表示；利用Excel 2010作图。

2 结果与讨论

2.1 单因素对桉叶多酚提取量的影响

2.1.1 提取温度的影响 由图1可知，提取温度从40℃向70℃递变时，多酚提取量有所上升，影响趋势不明显；当温度由70℃升高至80℃时，桉叶多酚的提取量明显升高。在溶剂浸提法中，随着提取温度的逐渐上升（30～70℃），桉叶中多酚提取量呈先上升后下降的趋势［16］，这是因为溶剂浸提法中温度升高会造成多酚氧化加速，而连续相变提取装置在工作中为完全密闭且真空的状态，隔绝空气，多酚物质不易发生氧化。考虑到连续相变提取装置中，采用循环水加热，其提取温度最高为80～90℃。故选取40，60，80℃作为优化连续相变提取法的3个提取温度水平。

图1 提取温度对桉叶多酚提取量的影响Figure 1 Effect of extraction temperature on the extraction yield

2.1.2 乙醇浓度的影响 由图2可知，乙醇浓度由40%向95%升高的过程中，多酚提取量先升高（6.80～7.48g/100g）后降低（7.48～2.73g/100g）。由于仪器客观条件所限，较低乙醇浓度情况下，溶剂相变速度较慢，仪器无法连续工作。综合各方面因素，选取40%，60%，80%作为优化连续相变提取法的3个乙醇浓度水平。

图2 乙醇浓度对桉叶多酚提取量的影响Figure 2 Effect of extraction solvent percentage on the extraction yield

2.1.3 提取时间的影响 由图3可知，在提取时间由20min升至70min的过程中，桉叶多酚的提取量呈显著上升趋势（4.52～8.01g/100g），70～120min过程中，桉叶多酚的提取量变化趋势不明显。这是由于多酚类物质在70min之内基本能够溶出。在溶剂浸提法中，桉叶多酚提取量呈先上升后下降的趋势，180min得到最高提取率［16］，这是因为溶剂浸提法提取效率低，多酚提取液暴露在空气中时间长易氧化。综合考虑选取30，60，90min作为优化连续相变提取法的3个提取时间水平。

图3 提取时间对桉叶多酚提取量的影响Figure 3 Effect of extraction time on the extraction yield

2.2 响应面优化提取工艺条件

2.2.1 响应面试验设计与结果 根据Box－Benhnken中心组合来进行试验设计，结合单因素试验结果，以提取温度、提取时间、乙醇浓度为因素，采用三因素三水平的响应面分析方法进行试验优化，试验因素水平设计见表1，试验结果见表2。

采用Design－Expert 8.05b软件对表2数据进行处理，得线性回归方程：

2.2.2 显著性分析 由表3可知，模型为极显著（P＝0.007 8＜0.01），回归决定系数R2＝0.904 1，说明响应值的变化有90.41%来自所选因素，由失拟项系数（P＝0.525 7＞0.05）不显著，可知该回归方程拟合度较好，可以利用该回归方程确定连续相变提取桉叶多酚的最佳工艺条件。各因素中，一次项X2影响极显著（P＜0.01），X1、X3影响显著（P＜0.05）。交互项X1X2的影响也是极显著的（P＜0.01），说明各单因素对响应值的影响存在非线性的关系。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2.2.3 响应面分析及优化 由表3以及图4、5可知，3个因素对于多酚提取量（Y）的影响皆显著，影响强弱大小为提取时间＞提取温度＞乙醇浓度。提取时间与乙醇溶度、提取温度与提取时间之间交互作用等高线图呈椭圆形，说明提取时间与乙醇溶度、提取温度与提取时间的交互作用对桉叶多酚提取量存在影响，但前者影响极显著，后者影响不显著。

根据 Design－Expert 8.05b软件分析得出，在提取温度79.99℃、提取时间119.98min、乙醇浓度78.13%的条件下，桉叶多酚提取量有最大值，其理论预测值为12.01g/100g。

表2 响应面试验结果Table 2 The results of response surface experiments

表3 回归分析结果Table 3 Analysis results of regression and variance

图4 提取时间和乙醇浓度对桉叶多酚提取量的影响Figure 4 Effect of extraction solvent percentage and extraction time on the extraction yield

图5 提取温度和提取时间对桉叶多酚的影响Figure 5 Effect of extraction temperature and extraction time on the extraction yield

2.2.4 验证实验 为方便操作对优化得到的工艺参数进行修整：提取温度取80℃，提取时间取120min，乙醇浓度取78%。并按修整后的条件进行3次验证实验，其桉叶多酚提取量为（11.58±0.83）g/100g，与理论预测值相近，相对偏差为3.65%。说明采用响应面分析法优化后得到桉叶多酚连续相变提取工艺参数较为可信，对实际生产具有一定指导意义。

2.2.5 连续相变提取法与超声波辅助提取法提取桉叶多酚的对比 由表4可知，本方法通过优化得到的最佳提取条件，相较超声波辅助提取法有更高的提取率，更少的提取时间和提取次数，并且提取之后无需过滤、浓缩等步骤，即可通过喷雾干燥制成桉叶多酚产品，极大降低了多酚提取的成本。连续相变提取法较超声波辅助提取法（超声波辅助提取装置、过滤装置、浓缩装置等）在前期设备投入方面相差不大，但具有较大节约生产成本的优势。

表4 连续相变提取法与超声波辅助提取法提取桉叶多酚的对比Table 4 The comparison of continuous phase transition extraction progress and Ultrasonic assisted extraction technology on eucalyptus'polyphenols rate

3 结论

（1）本试验研究了提取温度、时间和乙醇溶度对连续相变技术提取桉叶多酚得率的影响。结果表明，最佳的提取工艺条件为：提取温度80℃，提取时间120min，乙醇浓度78%，桉叶多酚提取量为（11.58±0.83）g/100g。

（2）连续相变提取法较微波辅助、超声辅助方法提取效率稍高，且省去过滤、浓缩步骤，生产成本低。由于连续相变提取装置的限制（循环水加热），提取温度有一定限度（80～90℃），本试验在提取温度优化方面还有一定不足。

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