四氢吡咯二硫代氨基甲酯对人脐静脉内皮细胞模拟缺血再灌注诱导炎症因子的影响

四氢吡咯二硫代氨基甲酯对人脐静脉内皮细胞模拟缺血再灌注诱导炎症因子的影响

曾敏吴智勇郑茵何扬利费毅刘肖君

(海南省人民医院，海南海口570311)

摘要〔〕目的通过四氢吡咯二硫代氨基甲酯(PDTC)研究核因子(NF)-κB对人脐静脉内皮细胞(HUVECS)模拟缺血再灌注后炎症因子表达的影响。 方法分为五组对HUVECs进行培养，即对照组(正常培养基培养)、缺血再灌注组(模拟缺血培养液培养30 min后换正常培养液再培养4 h)、缺血再灌注+0.1 mmol/L PDTC组、缺血再灌注+0.25 mmol/L PDTC组和缺血再灌注+0.5 mmol/L PDTC组。后三组均于模拟缺血再灌注培养前1 h在培养液中添加相应浓度PDTC。实时定量PCR和酶联免疫吸附法分别检测不同浓度PDTC对肿瘤坏死因子(TNF)-α、细胞间黏附分子(ICAM)-1 mRNA和蛋白表达水平的影响。 结果模拟缺血再灌注刺激TNF-α、ICAM-1的mRNA表达水平显著升高(P<0.05,P<0.01)。同时，模拟缺血再灌注刺激HUVECS上清液TNF-α和ICAM-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。0.1、0.25、0.5 mmol/L PDTC均显著降低模拟缺血再灌注所诱导的TNF-α和ICAM-1 的mRNA表达水平(P<0.05)。0.5 mmol/L PDTC显著降低模拟缺血再灌注所诱导的TNF-α和ICAM-1 的蛋白表达水平(P<0.05)。结论PDTC通过沉默p65，抑制模拟缺血再灌注诱导的TNF-α和ICAM-1表达水平。

关键词〔〕四氢吡咯硫代氨基甲酯；模拟缺血再灌注；人脐静脉内皮细胞

中图分类号〔〕Q291〔

基金项目：国家自然科学

第一作者：曾敏(1975-)，女，博士，主任医师, 主要从事冠心病方面的研究。

The effect of PDTC on the expression of pro-inflammatory factors under the condition of mimic ischemia/reperfusion in human umbilical vein endothelial cells

ZENG Min, WU Zhi-Yong, ZHENG Yin,etal.

The People's Hospital of Hainan Province, Haikou 570311, Hainan, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the regulation mechanism of pro-inflammatory after mimic ischemia/reperfusion (I/R)culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) with the utilization of PDTC.MethodsHUVECs were divided into control (culture with normal media), mimic I/R (mimic ischemic media cultured for 30 min followed by normal media cultured for 4 h), mimic I/R group+0.1 mmol/L PDTC, mimic I/R group +0.25 mmol/L PDTC and mimic I/R group + 0.5 mmol/L PDTC groups. For the latter 3 groups, HUVECs were treated with PDTC 1 h before mimic I/R. The expressions of TNF-αand ICAM-1 mRNA and protein as well as cell survival were determined by real-time PCR and ELISA assay, respectively.ResultsThe mRNA levels of TNF-α(P<0.05) and ICAM-1(P<0.01) were significantly increased by mimic I/R. Meanwhile, the protein levels of TNF-αand ICAM-1 were all significantly increased by mimic I/R (P<0.05). 0.1, 0.25, 0.5 mmol/L PDTC significantly decreased mRNA levels of TNF-αand ICAM-1 (P<0.05)。0.5 mmol/L PDTC significantly suppressed supernatant TNF-αand ICAM-1 protein levels (P<0.05).ConclusionsPDTC inhibited mimic I/R - induced expressions of TNF-α和ICAM-1.

【Key words】PDTC; Mimic ischemic/reperfusion; Human umbilical vein endothelial cells

炎症反应是参与缺血再灌注损伤的重要机制〔1〕。本研究通过体外模拟缺血再灌注培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，探讨缺血再灌注对炎症因子表达水平的影响，以及转录因子核因子(NF)-κB如何通过下游分子肿瘤坏死因子(TNF)-α、细胞间黏附分子(ICAM)-1调控细胞缺血再灌注损伤。

1材料与方法

1.1材料和试剂HUVEC(购自ATCC)，并采用添加了内皮细胞生长物、5%胎牛血清和青/链霉素的内皮细胞培养基常规培养(购自美国科学细胞研究实验室)。四氢吡咯二硫代氨基甲酯(PDTC)购自美国Sigma公司。 Trizol试剂(美国Invitrogen公司)； ScriptTM cDNA 合成试剂盒(BIO-RAD公司)；SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa公司)；CXCL16 ELISA试剂盒 (美国R&D Systems公司)。鼠抗人NF-κB p65抗体和鼠抗人β-actin抗体(美国Santa cruz公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养将HUVEC 细胞复苏后转移至新培养瓶,加入内皮细胞培养基中,置于37℃、5%CO2条件下孵箱内培养,5～7 d 传代1次,采用0.25% 胰蛋白酶消化细胞。

1.2.2实验分组分为正常对照组：正常内皮细胞培养基培养；缺血再灌注组(模拟缺血培养液培养30 min后换正常培养液再培养4 h)；缺血再灌注+0.1 mmol/L PDTC组(模拟缺血再灌注培养前1 h加0.1 mmol/L PDTC)；缺血再灌注+0.25 mmol/L PDTC组(模拟缺血再灌注培养前1 h加0.25 mmol/L PDTC)；缺血再灌注+0.5 mmol/L PDTC组(模拟缺血再灌注培养前1 h加0.5 mmol/L PDTC)。

1.3HUVEC细胞模拟缺血再灌注培养〔2〕将HUVEC细胞培养在包含118 mmol/L氯化钠,24 mmol/L碳酸氢钠,1.0 mmol/L磷酸钠,2.5 mmol/L氯化钙,1.2 mmol/L氯化镁,20 mmol/L乳酸钠,16 mmol/L氯化钾,10 mmol/L 2-脱氧葡萄糖(pH调至6.2)的“缺血液”中30 min，然后换为再灌注液即正常培养基进行再灌注4 h。

1.4实时定量RT-PCR检测TNF-α和ICAM-1用Trizol 试剂盒(Invitrogen公司) 抽提细胞总RNA。定量逆转录PCR使用ScriptTM cDNA 合成试剂盒。18S rRNA作为内对照。实时定量采用SYBR Premix Ex Taq和iQ5实时定量PCR检测系统(BioRad)。TNF-α引物，正义:5′-CCTGTGAGGAGGACGAACAT-3′，反义:5′-AGGCCCCAGTTTGAATTCTT-3′；ICAM-1引物，正义:5′-CAGAGGTTGAACCCCACAGT-3′，反义:5′- CCTCTGGCTTCGTCAGAATC-3′；18S rRNA引物正义:5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3′，反义:5′-GCTGGAATTACCGCGGCT-3′(引物均由北京三博远志公司合成)。逆转录反应:mRNA样品1 μg，iScript 逆转录酶1 μl,5倍 iScript 反应混合物4 μl，加无RNase 的双蒸水至20 μl ,轻轻振荡混匀,25℃温育5 min ,42℃温热30 min,85℃加热5 min。实时定量PCR 反应:cDNA逆转录产物2 μl ,正、反义引物各0.4 μl,SYBR预混剂10 μl(宝生物 DRR041A),焦碳酸二乙酯(DEPC)水(Sigma 公司)7.2 μl。反应条件:第一步95℃ 30 s；第二步95℃ 5 s，62℃ 30 s,运行40个循环；第三步55℃ 15 s，运行81个循环。每个样本3孔,取3 批实验的平均值。

1.5Western印迹检测NF-κB p65蛋白表达水平细胞蛋白样品用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，加人一抗即鼠抗人NF-κB p65多克隆抗体(1∶200)，鼠抗人β-actin抗体(1∶500)，4℃过夜。Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜3次，加辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠二抗(1∶10 000，中国中杉金桥公司)，室温1 h。TBST洗膜3次，加入显色底物硝基蓝四唑(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)避光显色。以Image J分析软件对图像进行灰度对比分析。将目的蛋白NF-κB p65条带的灰度与内参蛋白β-actin条带的灰度相比，以消除上样量差异的影响，对比各组样本蛋白表达水平的变化情况。

1.6酶联免疫吸附反应法(ELISA)测定TNF-α、ICAM-1可溶性蛋白收集各种实验条件下培养HUVECs的上清液，以1 000 r/min离心5 min后再取上清于-80℃低温冻存。采用美国R&D公司生产的TNF-α、ICAM-1检测试剂盒,应用双抗体夹心ELISA测定标本中TNF-α、ICAM-1水平,与其他相关蛋白无交叉反应。经过彻底洗涤后用底物四甲基联苯胺(TMB)显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的TNF-α、ICAM-1含量呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

2结果

2.1各组NF-κB p65蛋白表达水平比较模拟缺血再灌注刺激HUVECs NF-κB p65蛋白表达水平显著升高，达对照组的3.81倍(P<0.01)。作为NF-κB的特异性抑制剂，0.1、0.25、0.5 mmol/L PDTC均显著降低模拟缺血再灌注所诱导的NF-κB p65蛋白表达水平(P<0.01)。见图1。

2.2各组TNF-α和ICAM-1的mRNA 表达水平比较模拟缺血再灌注刺激TNF-α、ICAM-1的mRNA表达水平显著升高(P<0.05,P<0.01)。0.1、0.25、0.5 mmol/L PDTC均显著低于模拟缺血再灌注所诱导的TNF-α mRNA表达水平(P<0.01)。同时，均显著低于模拟缺血再灌注所诱导的ICAM-1的 mRNA表达水平(P<0.05，P<0.01)。见表1。

A：对照组；B：缺血再灌注组；C:缺血再灌注+0.1 mmol/L PDTC组；D:缺血再灌注+0.25 mmol/L PDTC组；E:缺血再灌注+0.5 mmol/L PDTC组；与缺血再灌注组比较：1)P<0.01 图1　各组NF-κB p65蛋白表达水平比较

组别TNF-αICAM-1正常对照组11.15±0.793.26±0.74缺血再灌注组19.73±1.212)12.04±0.831)缺血再灌注+0.1mmol/LPDTC组5.42±0.463)3.44±0.293)缺血再灌注+0.25mmol/LPDTC组5.70±0.803)4.03±0.754)缺血再灌注+0.5mmol/LPDTC组4.62±0.193)2.69±0.153)

与正常对照组比较：1)P<0.01，2)P<0.05；与缺血再灌注组比较：3)P<0.01，4)P<0.05

2.3ELISA检测各组上清液TNF-α和ICAM-1蛋白表达水平模拟缺血再灌注刺激HUVECs上清液TNF-α和ICAM-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。0.5 mmol/L PDTC显著低于模拟缺血再灌注所诱导的TNF-α和ICAM-1 的蛋白表达水平(P<0.05)。见表2 。

表2　各组上清液TNF-α和ICAM-1

与正常对照组比较：1)P<0.05；与缺血再灌注组比较：2)P<0.05

3讨论

众多证据表明,细胞因子参与了许多心血管疾病的病理过程〔3〕。在慢性充血性心力衰竭、动脉粥样硬化、心肌梗死、心脏术后内皮损伤以及心肌再灌注损伤等研究中证实,TNF-α和ICAM-1作为致炎细胞因子表达大量增加〔4～6〕。但是，心肌缺血再灌注时细胞因子如TNF-α、ICAM-1等升高的具体机制仍不十分清楚。

前期研究显示，NF-κB在内皮细胞缺血再灌注损伤机制中起重要作用〔2〕。NF-κB是Rel 蛋白家族成员,通常以p65/p50二聚体形式存在。静息状态下,NF-κB与κB抑制蛋白结合形成三聚体存在于细胞质中,细胞受到刺激后,通过信号传递,κB抑制蛋白从p65/p50/κB抑制蛋白三聚体上解离,p65/p50移位进入细胞核,与相应的DNA位点结合,启动下游基因转录〔7〕。Shakhov等〔8〕提示NF-κB对TNF-α的生成起重要作用。本研究与此一致。在心肌缺血再灌注损伤中，血管内皮细胞首先受到刺激，细胞胞质内NF-κB被激活，参与了ICAM以及促炎细胞因子如TNF-α、ICAM-1等表达的调控，使这些因子表达增高，造成组织损伤，而且此过程中产生的TNF-α又是NF-κB的强诱导剂〔9〕，能进一步激活NF-κB，形成恶性循环加重再灌注损伤的程度。对大鼠肠缺血再灌注后的研究中〔10〕也发现，缺血再灌注后白细胞浸润明显，NF-κB和ICAM-1表达增高，在缺血再灌注损伤中起着重要作用。NF-κB介导的黏附分子的异常表达是再灌注损伤的重要环节。Chen等〔11〕研究显示，蛋白酶体抑制剂硼替佐米可通过抑制NF-κB活化来减少ICAM-1、TNF-α等炎症因子的高表达，能有效减轻细胞再灌注损伤。正常情况下,淋巴细胞功能相关性抗原(LFA)-1与ICAM-1 的黏附能力很弱,粒细胞不能发挥其作用。但是在各种刺激下,细胞释放的TNF-α等细胞因子可以促进ICAM-1等黏附分子的表达,这些黏附分子进一步增强粒细胞与内皮细胞的黏附,引发微循环障碍,加之粒细胞的破坏作用,从而协同促进组织脏器的再灌注损伤〔12〕。本实验提示缺血再灌注中NF-κB可能通过调节下游靶基因TNF-α和ICAM-1 mRNA转录而最终影响该炎症因子的蛋白表达水平，产生相应的病理生理作用。

综上,转录因子NF-κB诱导细胞因子TNF-α和ICAM-1的高表达，介导缺血再灌注损伤中的炎症反应。通过PDTC抑制缺血再灌注过程中TNF-α和ICAM-1的表达和释放将有助于炎症反应的改善,进而减轻再灌注损伤。研究提示以NF-κB 作为干预靶点来预防和治疗再灌注具有很大潜力，但是尚需要更多的基础及临床实验为NF-κB 在再灌注治疗中的广泛应用提供理论依据。

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〔2013-12-24修回〕

(编辑袁左鸣)