贝母素甲对内毒素性急性肺损伤小鼠炎症因子表达的影响

贝母素甲对内毒素性急性肺损伤小鼠炎症因子表达的影响

归改霞夏西超马瑜红梁桂娜丁可刘荣志

(南阳医学高等专科学校基础医学部，河南南阳473061)

摘要〔〕目的探讨贝母素甲(PM)对脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肺损伤过程中炎症因子表达的影响。方法80只昆明种小鼠体重(20±5)g随机分成正常组、模型组、地塞米松(Dex)组、PM组，腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉小鼠，模型组、Dex组及PM组小鼠给予气管内注射4 mg/kg LPS诱导建立急性肺损伤模型。注入LPS前1、12、24 h和36 h和注入后12 h，24 h和36 h，模型组、Dex组、PM组动物分别给予生理盐水、10 mg/kg盐酸地塞米松、1 mg/kg PM溶液，正常组给予同等体积生理盐水。实验结束后解剖肺脏，观察肺脏形态学改变，分别用Real-Time PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)测定肿瘤细胞坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-2、IL-6和IL-8。结果LPS能明显引起小鼠肺部的炎症反应，PM处理后拮抗了LPS对小鼠肺组织的破坏作用，抑制促炎因子TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8的表达。结论PM对急性肺损伤小鼠肺组织保具有保护作用，其机制可能与下调炎症因子的表达有关。

关键词〔〕贝母素甲；急性肺损伤；肿瘤坏死因子；白介素-2；白介素-6；白介素-8

中图分类号〔〕R363〔文献标识码〕A〔

基金项目：河南省重点科技攻关项目(122102310103)

通讯作者：刘荣志(1970-)，男，教授，主要从事细胞增殖分化调控研究。

第一作者：归改霞(1977-)，女，讲师，主要从事细胞增殖分化调控研究。

炎症反应在急性肺损伤(ALI)发生发展过程中起关键作用〔1～3〕。贝母是百合科多年生草本植物，是常用的治疗肺部炎症的中药，具有清热化痰、解毒等作用〔4～6〕。贝母素甲(PM)为贝母的主要活性成分之一，属于生物碱类物质〔7，8〕，但其在ALI中的应用未见报道。本研究拟建立小鼠ALI模型，观察肺组织病理学改变，检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-2、IL-6和IL-8的mRNA和蛋白含量的变化。

1材料和方法

1.1主要试剂PM、脂多糖(LPS)、地塞米松(Dex)、均购自阿拉丁试剂有限公司，Trizol试剂、RTase M-MLV，dNTP mixture、SYBR Premix Ex TaqTM等购自大连宝生物生物工程有限公司，引物合成由上海生工生物工程公司合成，酶联免疫(ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，PM的配制：称取1 mg后，加入双蒸水1 ml，加入1 mol/L HCl溶解，调pH为7.0，最终稀释为100 μg/ml，微孔滤膜过滤除菌，分装，4℃保存备用，其他试剂均为实验级别。

1.2动物模型建立雄性昆明种小鼠(SPF级)80只，4～8 w龄，体质量20～30 g，购于河南省实验动物中心，分笼饲养，自由饮水与摄食，随机平均分为正常组、模型组、Dex组、PM组。腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉小鼠，模型组、Dex组及PM组小鼠给予气管内注射4 mg/kgLPS诱导建立ALI模型。注入LPS前1 h、12 h、24 h和36 h和注入后12 h，24 h和36 h，五组动物分别给予生理盐水、10 mg/kg盐酸地塞米松、1 mg/kg PM溶液，正常组给予同等体积生理盐水。实验结束后解剖肺脏，液氮速冻。

1.3病理学观察肺部病理学观察采用HE染色方法，主要步骤：取材、固定、脱水透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、染色和封片，然后在光镜下观察小鼠肺部形态学观察。

1.4肺脏TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8的mRNA水平分析RNA提取采用RNAiso Plus提取小鼠肺组织RNA，总RNA的完整性和纯度分别用凝胶电泳和分光光度计检测。按照PrimeScriptTM RT试剂盒操作说明合成cDNA第一链。根据目的基因和内参基因β-actin保守区域设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成，各引物序列分别为：TNF-α正义链5′ACTGGGCATCCTTTGTCGG3′,TNF-α反义链5′CTGTTGGTGAAGAGGTGCGG3′；IL-2正义链5′ATCGTGGGTGGCGTTGAG3′，IL-2反义链5′GTTCTGGCGGATGTTGTGG3′；IL-6正义链5′CTCAGGACGGTAAGTGTCGCTT3′，IL-6反义链5′TGGTAGAACTGGAAGGACGGCT3′；IL-8正义链5′GGGTTCCTTACTCCGCTTTCG3′，IL-8反义链5′GTCAGTGCCTTGGTTCAGGTCG3′；β-actin正义链5′CATCCACGAGACCACCTACAAC3′，β-actin反义链5′GAAATACTGCCTCGCTCCCTC3′。TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8 mRNA水平分析采用ABI7500型 real-time PCR，反应体系SYRB Premix Ex TaqTM试剂盒要求进行。结果采用2-△△ct法进行分析。

1.5肺脏TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8蛋白含量测定TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8测定参照ELISA试剂盒要求进行。组织匀浆，离心，加入酶，37℃温育，PBS缓冲液洗版，然后加入酶复合物，37℃温育，PBS缓冲液洗版，加入底物，室温温育，最后加入终止液，在450 nm处观察OD值。

1.6统计学方法采用SPSS10.0软件进行ANOVA和Brown-forsythe相结合法、LSD法和Tamhane法。

2结果

2.1肺脏病理学改变正常组肺组织结构完整，肺泡腔清晰，无渗出物，肺泡壁无增厚，肺泡间质无炎性细胞浸润，肺泡隔均匀一致。模型组肺组织的结构破坏明显，肺泡大小不一，肺泡壁明显水肿增宽，肺泡腔萎陷，并伴有出血，血管周围间隙增宽，肺泡间质内有大量炎症细胞浸润，部分肺间隔变薄、断裂，有肺气肿形成。与模型组相比，PM组小鼠肺组织的损伤有明显程度减轻。见图1。

图1　各组小鼠肺脏病理学结果(HE，×400)

2.2各组动物TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8 mRNA水平的比较与正常组和Dex组相比，模型组TNF-α、IL-2、IL-6和 IL-8 mRNA水平明显升高(P<0.05，P<0.01)。与模型组比较，PM组TNF-α，IL-2，IL-6和IL-8 mRNA含量分别减少了53.28 %(P<0.01)，67.93%(P<0.01)、59.09%(P<0.01)和54.42 %(P<0.01)。见表1。

组别TNF-αIL-2IL-6IL-8正常组0.64±0.130.87±0.090.71±0.110.77±0.199模型组2.59±0.362)3.68±0.542)1.98±0.332)2.26±0.452)Dex组1.11±0.181)4)1.07±0.244)1.25±0.311)3)1.31±0.221)3)PM组1.21±0.341)4)1.18±0.274)0.81±0.204)1.13±0.324)

与正常组比较：1)P<0.05,2)P<0.01，与模型组比较：3)P<0.05,4)P<0.01，下表同

2.3各组动物TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8蛋白水平的比较ELISA结果显示，与正常组和Dex组相比，模型组TNF-α，IL-2，IL-6和 IL-8蛋白水平明显升高(P<0.01)。与模型组比较，PM治疗组TNF-α，IL-2，IL-6和IL-8蛋白含量分别减少了71.71 %(P<0.01)，64.96 %(P<0.01)、44.18 %(P<0.01) 和47.8 %(P<0.05) 。见表2。

组别TNF-αIL-2IL-6IL-8正常组18.20±2.0320.17±3.8819.65±4.3221.33±5.38模型组129.75±6.32)91.43±4.052)83.63±6.812)73.54±4.562)Dex组52.15±5.692)4)24.27±3.424)30.87±6.151)4)37.92±4.541)3)PM组36.71±4.731)4)32.03±5.084)38.28±4.151)4)38.33±6.671)3)

3讨论

ALI/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是临床常见的危重病，其发生和发展涉及多种病理生理过程的参与，其中炎症反应是其重要表现之一〔1，9〕。LPS能通过启动并放大机体的炎症反应，造成中性粒细胞等炎症细胞在肺部的积聚，是导致ALI的重要病因之一〔10〕。

本研究提示LPS处理后能启动一系列信号转导机制，激活多种炎症细胞和效应细胞，释放大量炎症介质或细胞因子，PM对ALI小鼠的肺脏具有保护作用，其原因与抑制促炎因子的释放有关。TNF-α对肺有强烈的毒性，异常表达的TNF-α与肺组织TNF-α受体结合，导致溶酶体受损，释放大量酶类，直接损伤肺血管内皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞，引起肺部水肿和炎症反应〔10，11〕。此外，TNF-α可诱导巨噬细胞合成并释放IL-6、IL-8等促炎性细胞因子，使中性粒细胞变形、释放过氧化物和溶酶体，加速炎症反应，造成肺组织损伤〔10〕。作为炎症因子IL-2能促进IFN-γ、IL-5、IL-6、TNF-β等炎症因子的产生〔9，11〕。抑制肺脏炎症因子发生，实现细胞保护作用研究已多有报道。如Dex能明显减少TNF-α、IL-2和IL-6含量来降低LPS对肺泡的损伤〔11〕，维生素D3及其同系物能够下调IL-8的表达来抑制急性肺炎和肺癌发生和发展〔12，13〕。

机体发病过程中，促炎细胞因子和抗炎细胞因子的相互作用介导着炎症发生和发展，两者之间的平衡有助于维持机体环境稳定。不难看出一个相对低的促炎性细胞因子或者一个相对高的抗炎因子表达，将有助于组织和器官损伤的修复；反之，则引起过度炎症反应，损伤组织和器官〔14～16〕。因此，PM处理后抑制促炎因子TNF-α、 IL-2、IL-6和 IL-8的表达，有助于实现对小鼠肺脏损伤起到保护作用。

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〔2014-03-09修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)