中药对衰老合并糖尿病小鼠模型的治疗效果

中药对衰老合并糖尿病小鼠模型的治疗效果

黄春燕王娜彭彦桦杨夏玉李连张树球何胜

(右江民族医学院重金属与氟砷毒物研究实验室,广西百色533000)

摘要〔〕目的探讨衰老合并糖尿病(DM)小鼠模型的建立、与老年痴呆关系及中药治疗。方法小鼠40只，分成四组：治疗1组、治疗2组、模型组、正常组，每组10只，前3个为造模组，用链脲佐菌素(STZ)连续注射2 d后，再用四氧嘧啶(ALX)对小鼠进行间断腹腔注射2 d，共注射4 d，建立DM模型；在此基础上，12 d后皮下注射D-半乳糖和亚硝酸钠33 d，每日一次。实验至35 d开治中药治疗，治疗15 d结束实验。测定造模前，造模后，治疗前、后的血糖含量及结束时血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量。处死动物，取大脑制成10%脑匀浆，测定脑蛋白、乙酰胆碱酯酶(AchE)、谷胱甘肽(GSH)、O-2·清除率、丙二醛(MDA)等。结果模型组和正常组血糖，造模前、造模后6 d、9 d血糖，模型组与正常组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；造模后18、20、26、46 d血糖模型组与正常组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。治疗前血糖含量治疗1组、治疗2组、模型组、与正常组比较差异均有统计学意义(P<0.01)；治疗后各组血糖含量与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01)；血清TG治疗组明显降低；TC治疗1组明显降低；脑匀浆AchE正常组、治疗组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；脑匀浆 清除率%治疗组明显升高；脑匀浆GSH模型组明显低于正常组和治疗1组；脑匀浆MDA各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论衰老合并DM小鼠模型治疗后血糖、血脂明显降低，脑O-2·清除率、GSH明显升高，AchE活力也有一定改变。

关键词〔〕糖尿病；衰老；血糖

中图分类号〔〕R587.1〔文献标识码〕A〔

基金项目：广西科技厅项目(桂科攻9819009号)

通讯作者：何胜(1962-),男，副教授，主要从事抗衰老药物的研发与应用研究。

第一作者：黄春燕(1993-)，女，本科在读，主要从事老年基础医学研究。

糖尿病(DM)患者合并阿尔茨海默病(AD)的发病率高于正常人〔1，2〕，DM患者又患上AD，其病情严重程度以及治疗效果如何，他们之间是否有因果关系，值得探讨。衰老DM模型，通常选用老龄大鼠注射链脲佐菌素/四氧嘧啶造模，但成功率低(血糖不高)且死亡率高〔3〕。本实验为缩短时间、提高成功率，试用鼠龄小的小白鼠，用链脲佐菌素(STZ)加四氧嘧啶(ACX)腹腔注射，建立DM，然后皮下注射D-半乳糖加亚硝酸钠〔4〕，建立拟衰老；并用中药治疗，测定各时期的血糖含量及结束时的各种生化指标，并进行对比分析。

1材料与方法

1.1主要试剂STZ、ALX均为Sigma 产品、邻甲苯胺、硫脲、硼酸、冰醋酸、过硫酸铵、盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、α-萘胺、盐酸(Hcl)、三甲基安基甲烷(Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)、正丁醇，均为国产分析纯。甘油三酯(TG)测定试剂盒、总胆固醇(TC)测定试剂盒、乙酰胆碱酯酶(AchE)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒、蛋白质测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。

1.2动物选用健康鼠明种小白鼠40只，由右江民族医学院动物室提供(动物使用许可证：SYXK桂2011-0010，动物生产许可证：SCXK桂2012-0003)，雌雄各半，鼠龄2～3个月。体重质量20～25 g。由动物室提供的混合饲料喂养，自由饮水。将白鼠分成四组：治疗1、2、3组、正常组，每组10只。分笼喂养，5只/笼，编号，称体重，测定小鼠血糖。

1.3药物舒糖宝，用荔枝，番石榴等果类提取制成；抗痴何首乌复方1号和2号，用何首乌，龙眼肉等不同配方中药提取制成。

1.4实验方法衰老DM模型的建立〔5，6〕和中药治疗〔4〕，除正常组(10只)外，其余各组(共30只)用链脲佐菌素按76.7 mg/kg体重剂量，用pH4.2的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液15 ml溶解后，作腹腔注射，1次/d，连续2 d，第3天改用四氧嘧啶(按110 mg/kg体重)用蒸馏水溶解后，作腹腔一次注射，注射后1 w再用四氧嘧啶(按220 mg/kg体重)，作腹腔一次注射。DM造模12 d后，用D-半乳糖(按100 mg·kg-1·d-1)和亚硝酸钠(45 mg·kg-1·d-1)〔3〕，生理盐水溶解后连续皮下注射33 d，每日一次，建立衰老糖尿病。测定造模后6、9、18、20、26 d血糖。造模35 d后，开始中药治疗。治疗1组每鼠用舒糖宝0.15 ml原液，蒸馏水稀释成0.3 ml灌胃，每日一次；治疗2组每鼠用舒糖宝0.05 ml原液，蒸馏水稀释成0.3 ml灌胃，每日一次，连续3 d；第4天起改药，治疗1组每鼠用抗痴何首乌复方1号0.1 ml原液，蒸馏水稀释成0.3 ml灌胃，1次/d；治疗2组每鼠用抗痴何首乌复方2号0.1 ml原液，蒸馏水稀释成0.3 ml灌胃，1次/d。模型组用等量蒸馏水代替，方法相同。连续治疗15 d结束；测定治疗前后血糖含量。

1.5测定方法血糖测定，从小白鼠尾巴取静脉血20 μl，用邻甲苯胺微量法测定〔7〕；超氧阴离子自由基O-2·清除率测定，用化学比色法，参考文献〔8〕；TC用COD-CE-PAP法测定；TG用GPO-PAP法测定；蛋白质测定用考马斯亮蓝微量法，丙二醛(MDA)用硫代巴比妥酸(TBA)显色法测定；GSH测定用GSH可与二硫代二硝基苯甲酸作用生成黄色化合物，进行比色测定；AchE测定用AchE催化水解乙酰胆碱生成胆碱和乙酸，胆碱与巯基显色剂反应生物TNB黄色化合物，比色测定。具体操作均按试剂盒说明书操作。

1.6实验取材从眼球取血，分离血清待测。处死动物，取大脑，用生理盐水洗去血液，滤纸吸干多余水分，称重，在冰浴下用玻璃匀浆器匀浆，用生理盐水制成10%脑匀浆，在3 000 r/min离心10 min，取上清于另一试管内，放冰箱内冷冻待用。

1.7统计学方法用SPSS13.0软件进行方差分析与q检验。

2结果

2.1造模前后各组小鼠空腹血糖(FPG)含量比较造模前模型组与正常组比较，FPG含量差异无统计学意义。造模后6 d、9 d，造模组与正常组比较差异显著(P>0.05)。见表1。

2.2DM小鼠注射D-半乳糖及亚硝酸钠后血糖比较DM造模后18、20、26 d(对应痴呆造模5、7、13 d)，造模组与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

2.3DM小鼠治疗前后血糖比较治疗前各组明显高于正常组(P<0.01)；治疗后各组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，治疗组明显下降。见表3。

组别n造模前造模后6d造模后9d造模组305.35±1.037.39±1.371)7.47±1.711)正常组105.46±1.245.64±1.096.21±0.89

与正常组比较：1)P<0.05

组别n造模后18d(痴呆造模5d)造模后20d(痴呆造模7d)造模后26d(痴呆造模13d)造模组3015.28±0.361)14.22±3.591)12.29±2.671)正常组107.10±0.926.82±2.996.45±1.01

与正常组比较：1)P<0.01

2.4各组治疗后血脂及脑匀浆AchE测定结果治疗组TG明显低于模型组和正常组(P<0.01)；治疗1组TC明显低于其他三组(P<0.05)；模型组AchE明显高于正常组、治疗2组(P<0.05)。见表4。

2.5小鼠治疗后10%脑匀浆中脑蛋白、GSH、O-2·清除率、MDA比较10%脑匀浆中脑蛋白各组间差异无统计学意义(P>0.05)。模型组GSH明显低于正常组和治疗1组(P<0.05)。 清除率治疗1组明显高于正常组和模型组，治疗2组明显高于正常组(P均<0.05)。MDA各组间差异无统计学意义(P均>0.05)。见表5。

组别治疗前治疗后(16d)治疗后(16d,酶法)治疗1组10.78±1.081)7.30±1.402)7.34±1.222)治疗2组13.87±3.491)8.80±1.352)9.63±0.482)模型组12.39±2.781)12.39±1.1911.24±1.31正常组6.45±1.016.54±0.472)6.21±0.402)

与正常组比较：1)P<0.01，与模型组比较：2)P<0.01

组别nTG(mmol/L)TC(mmol/L)脑AchE(U/mg)治疗1组101.39±0.131)2)1.46±0.330.732±0.042治疗2组81.59±0.171)2.46±0.444)0.677±0.1392)模型组82.09±0.302.71±0.494)0.850±0.068正常组81.81±0.302.44±0.654)0.670±0.2562)

与模型组比较：1)P<0.01,2)P<0.05；与正常组比较：3)P<0.05；与治疗1组比较：4)P<0.01

组别脑蛋白(mg/ml)GSH(mg/gprot)O-2·清除率(%)MDA(nmol/mg)治疗1组3.385±0.2001.209±0.1851)34.74±2.310.109±0.019治疗2组3.435±0.1331.098±0.10731.71±2.430.103±0.019模型组3.608±0.1570.827±0.05726.22±2.433)0.115±0.012正常组3.637±0.1801.383±0.2222)29.27±4.630.111±0.012

与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与治疗1组比较：3)P<0.05

3讨论

本研究用STZ和ALX造模后6、9 d，连续二次测定，血糖升高，但均不明显，造模组与正常组比较，差异显著，研究中所用的STZ和ALX剂量已比较大，鼠龄小，体重轻(2月，20～25 g)，可能是小鼠对STZ和ALX不太敏感。D-半乳糖常用来建立老年痴呆动物模型，近年有研究用它和STZ一起来建立衰老糖尿病大鼠模型〔5〕，均得到较好的效果，本研究认为D-半乳糖长时间大量在体内积累，引起半乳糖代谢紊乱，产生了多种不良后果，其一半乳糖还原成半乳糖醇在细胞内积累，引起细胞内渗透压升高，细胞肿胀，代谢紊乱，功能障碍，加速衰老；其二是抗氧化系统受损，自由基增加，加速衰老；也有研究认为，长时间注射D-半乳糖可诱导胰岛素抵抗(IR)，影响胰岛素的合成和分泌，可导致糖代谢紊乱，形成衰老DM大鼠模型。因此，本实验开始用STZ和ALX造模DM时，血糖升高不明显，注射D-半乳糖后明显升高，说明是D-半乳糖所起的作用，衰老加速了DM的发生或加重了糖尿病的病情。

衰老和DM均会造成机体抗氧化功能降低和自由基的增加，O-2·清除率、 GSH下降，治疗组所用的何首乌复方制剂，主要有效成分之一是二苯乙烯苷有提高GSH、清除氧自由基的能力，因而提高了清除率。因而使衰老好转，DM也有一定好转。脑中AchE活力，是与记忆功能有密切关系的酶类，在脑中主要分布于海马和皮层部位，在AD中常发生活力改变，也是目前AD测定的关键指标，但可能在发病不同阶段会有不同的变化，因而在文献报道中，有升高或降低的，本实验降低了，可能是其原因。 MDA含量各组比较无差异，可能是注射D-半乳糖时间较短或剂量偏低的原因，但有待进一步探讨。

4参考文献

1樊华.糖尿病与阿尔茨海默病发病风险相关性研究进展〔J〕.实用老年医学，2010；24(4)：342-4.

2罗伯特.糖耐量减低提示阿尔茨海默病高风险〔J〕.糖尿病天地临床刊，2011；5(11)：499.

3王小英，肖柳英，潘竞锅，等.甘草对抗D-半乳糖诱导大鼠糖尿病模型的实验研究〔J〕.药物研究，2007；16(13)：8-9.

4陈莉，刘小艳，黄日越，等.乌圆补血口服液对D-半乳糖和亚硝酸钠所致痴呆模型小鼠生化指标的影响〔J〕.中国老年学杂志，2009；29(10)：1206-7.

5施红，王晓宁，余文珍，等.化学药物诱导构建衰老糖尿病大鼠模型〔J〕.中国老年学杂志，2008；28(24)：2416-7.

6朱以良，杨李，文哗.链尿佐菌素一次和二次注射在2型糖尿病肾病大鼠模型制作中的比较〔J〕.实用医杂志，2009；25(16)：2649-50.

7安乙敏.生化检验学〔M〕.成都：四川科学技术出版社，1990：68.

8萧华山，何文锦，傅文庆，等.一种用分光光度计检测氧自由基的新方法〔J〕.生物化学与生物物理进展，1999；26(2)：180-2.

〔2014-04-29修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)