低分子肝素对脓毒症大鼠可溶性血栓调节蛋白、可溶性内皮细胞蛋白C受体及可溶性E-选择素的影响

低分子肝素对脓毒症大鼠可溶性血栓调节蛋白、可溶性内皮细胞蛋白C受体及可溶性E-选择素的影响

崔雷程青虹1何永来1赵利曾建琼1

(石河子大学医学院，新疆石河子832002)

摘要〔〕目的探讨低分子肝素对脓毒症大鼠肺血管内皮细胞功能的影响。方法采用大鼠盲肠结扎穿孔术(CLP)复制大鼠脓毒症模型。清洁级雄性Wistar大鼠104只被随机分为正常对照组、假手术组、脓毒症模型组和低分子肝素治疗组，每组8只，其中后三组按术后处死时间分为12、24、48、72 h共4个亚组。各组分别在相应时间点处死大鼠，经腹主动脉取血进行常规检测，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定可溶性血栓调节蛋白(sTM)、可溶性内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)浓度以及炎症反应可溶性E-选择素(sE-selectin)的含量。结果正常对照组和假手术组sTM、sEPCR和sE-selectin的表达水平均无显著差异(P均>0.05)。脓毒症模型组伤后12 h开始在各个时间点sTM、sEPCR和sE-selectin的表达均有不同程度增高(P均<0.05)，并持续至伤后72 h；与模型组比较，低分子肝素治疗组于CLP后12 h开始，至24、48 h，sTM、sEPCR和sE-selectin的表达均明显降低，并持续至72 h(P均<0.05)。结论低分子肝素能通过对脓毒症凝血-炎症网络的调节，降低脓毒症大鼠sTM的表达水平，并降低大鼠体内sE-selectin的水平，从而减轻肺组织炎症损害，在一定程度上缓解脓毒症的进程。

关键词〔〕脓毒症；低分子肝素；可溶性血栓调节蛋白；可溶性内皮细胞蛋白C受体；可溶性E-选择素

中图分类号〔〕R631〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81160017)

通讯作者：程青虹(1967-)，男，主任医师，硕士，主要从事重症医学研究。

1石河子大学医学院第一附属医院重症医学二科

第一作者：崔雷(1985-)，男，住院医师，在读博士，主要从事重症医学研究。

Effect of the low-dose heparin on STM and sE-selectin in septic rats

CUI Lei,CHENG Qing-Hong,HE Yong-Lai,etal.

Shihezi University School of Medicine,Shihezi 832002,Xinjiang,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of low-dose heparin injection on pulmonary vascular endothelial cell function of sepsis rats.MethodsSepsis model was produced by cecal ligation and puncture(CLP). 104 healthy male Wistar rats were randomly divided into control,sham operation,cecal ligation and puncture(CLP) model group,and low-dose heparin-treated groups. The three latter groups were divided into four subgroups of 12,24,48 and 72 h with 8 rats in each subgroup. The blood samples of each group were collected at various time points from abdominal aorta to determine the levels of sTM,sEPCR and sE-selectin expression by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsThe levels of STM,sEPCR and sE-selectin expressions had no significant differences among control and sham operation groups(both P>0.05). STM,sEPCR and sE-selectin expressions levels were significantly increased beginning at 12 h in post-CLP(all P<0.05),and were decreased continuing at 72 h. Also,low-dose heparin dramatically decreased STM,sEPCR and sE-selectin levels at 12 h,and markedly decreased at 48 and 72 h compared with those of model group(all P<0.05).ConclusionsLow molecular heparin could pass to sepsis coagulation-inflammation network adjustment,reduce the expression levels of sTM and sE-selectin in sepsis rats so as to reduce the inflammation of lung tissue damage,and it could obviously alleviate the development of sepsis at a certain extent.

【Key words】Sepsis;Low-dose heparin;sTM;sEPCR;sE-selectin

异常的凝血系统和炎症反应在脓毒症发生发展过程中起到重要作用，是脓毒症及多器官功能障碍综合征(MODS)发生的重要机制之一；且脓毒症与急性肺损伤的病理生理过程类似，都包括由宿主失控的防御反应引起炎症、内皮细胞损伤、促凝活性加强及纤溶活性下降等〔1〕。肝素可激活抗凝血酶发挥抗凝作用，在脓毒症治疗领域逐渐凸显其应用潜力。低分子肝素(LMWH) 是经肝素降解所得的低分子量片段或经分级法得到的4 000～6 500 D低分子量组分。该组分具有抗凝血、抗血栓、抗肿瘤等作用，具有生物利用度高、血浆半衰期长、出血副作用少等特点，现已成为肝素类药物研究的焦点〔2〕。本实验采用盲肠结扎穿孔术(CLP)复制大鼠腹腔感染的脓毒症模型，研究LMWH对脓毒症大鼠肺血管内皮细胞功能的影响，探讨LMWH在脓毒症防治方面的可能机制。

1材料与方法

1.1材料清洁级雄性Wistar大鼠104只，体重220～260 g，购自新疆医科大学医学动物中心。正式实验前适应性喂养2 w。低分子肝素钠注射液(1 ml：2 500 IU)，杭州九源基因工程有限公司；酶联双抗体夹心ELISA试剂盒，美国Gene May有限公司；TECAN DNA export酶标仪，TECAN公司；FRESCO台式低温离心机，贺利氏公司。

1.2动物分组及处理因素随机分为正常对照组、假手术组、脓毒症模型组(CLP)和LMWH组，后三组再分为术后12、24、48和72 h组，每组8只。麻醉后开腹，假手术组仅翻动盲肠，LMWH组经CLP术后立即皮下注射LMWH钠注射液(100 U/kg)，CLP组行盲肠结扎术并穿孔，并注射等量生理盐水。注射LMWH后在每个时间点每组采血，处死大鼠并取肺组织。应用ELISA法测定血清可溶性血栓调节蛋白(sTM)、可溶性内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)以及可溶性E-选择素浓度。

1.3动物模型制备按照Chaudry等〔3〕的方法行CLP，复制严重腹腔感染致脓毒症模型。

1.4指标的检测方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法原理定量测定，严格按照试剂盒说明书进行测定。

1.5统计学方法应用SPSS17.0软件行方差分析。

2结果

2.1LMWH对脓毒症大鼠sTM的影响假手术组与正常对照组比较无统计学差异(P>0.05)；与正常对照组和假手术组相比CLP组和LMWH组中sTM在各时间段的表达水平均显著升高(P均<0.01)；但与CLP组相比，LMWH组大鼠sTM表达量在各个时间点均有所下降，12 h显著下降，并持续下降至72 h(P均<0.01)。见表1。

2.2LMWH对脓毒症大鼠sEPCR的影响正常对照组和假手术组在各时间点的sEPCR含量无差异(P均>0.05)；而CLP组和LMWH治疗组sEPCR含量均显著高于正常对照组和假手术组(P<0.05)。与CLP组比较，LMWH治疗后的sEPCR含量显著降低(P<0.05)。见表2。

2.3LMWH对脓毒症大鼠sE-selectin的影响正常对照组和假手术组各时点sE-selectin无差异(P均>0.05)；与正常对照组和假手术组相比较，CLP后12 h内sE-selectin开始上升，随时间延长，sE-selectin含量呈逐渐上调的趋势，24 h达高峰，且持续至伤后72 h(P均<0.05)。而与CLP组比较，LMWH组sE-selectin表达较CLP后12 h有所下降，于术后24 h进一步降低，持续至72 h(P均<0.05)。见表3。

组别正常对照组假手术组CLP组LMWH组12h20.8±4.321.9±3.930.6±5.11)23.4±3.41)2)24h21.6±3.820.8±4.153.6±7.11)41.5±4.21)2)48h22.6±4.122.0±4.276.2±9.21)41.9±5.11)2)72h21.9±4.021.9±4.177.8±9.41)39.6±4.61)2)

与对照组比较：1)P<0.05；与CLP组比较：2)P<0.05；下表同

组别正常对照组假手术组CLP组LMWH组12h116.2±5.7117.3±6.0165.3±9.61)155.2±8.91)2)24h117.3±6.0118.0±5.7163.2±8.71)150.3±7.61)2)48h115.8±6.1119.6±6.2169.1±9.01)146.0±6.71)2)72h118.0±6.3118.3±5.9161.3±7.61)132.6±6.41)2)

组别正常对照组假手术组CLP组LMWH组12h11.6±1.010.1±1.222.3±3.21)15.3±2.11)2)24h10.4±1.211.7±0.950.9±3.01)21.4±2.81)2)48h12.8±0.911.0±1.051.6±2.51)30.2±2.31)2)72h10.5±1.111.2±1.146.9±3.11)25.6±2.21)2)

3讨论

机体发生脓毒症时，炎症细胞过度激活，可通过各种途径激活凝血系统，随即机体产生抗凝物质并启动纤溶系统。同时，纤溶系统及生理性抗凝系统受到不同程度地抑制，血液处于高凝状态，微血管内微血栓大量形成，从而微循环障碍〔4〕。随后，人们逐步认识到脓毒症是炎症反应，是凝血/纤溶系统障碍及免疫功能紊乱等众多因素相互影响、相互作用的结果。

Cornet等〔5〕曾指出肝素(类肝素样物质)可能发挥与活化蛋白C相同的抗凝及抗炎作用，且肝素价格便宜，易获取。有研究〔6〕报道LMWH除具有抗凝作用外，另外还具有抗血栓这一重要作用。由于凝血酶的激活是血栓形成的主要原因之一，而LMWH具有较强抗FXa作用，因此能够抑制凝血酶的激活；LMWH还具有抑制血小板聚集〔7〕、降低血液黏度、改变血液流变特性、维持血液正常的流动等作用。以上特性说明低分子肝素具有抗血栓作用。曹苹等〔8〕结果表明LMWH对凝血系统的作用低于普通肝素(UFH)，而其抗血栓作用大于UFH。

血管内皮细胞在对抗血小板聚集、维持血管壁完整性等方面均具有重要的意义，并且还参与调节纤溶过程。E-selectin作为内皮细胞合成的一种表面糖蛋白，是细胞黏附分子选择素家族成员之一，不仅能够介导白细胞在血管内皮表面的运动，还与肿瘤细胞的转移有着密切的联系〔9〕。由于正常组织中的内皮细胞一般不表达E-selectin，只有当内皮细胞受到某些细胞因子刺激而被激活时才表达，因此E-selectin表达水平可在一定程度上反映癌症的病理进展及转移情况。E-selectin属于黏附分子选择素家族，主要表达于活化的内皮细胞与多种肿瘤患者内皮细胞表面，释放入血后成为sE-selectin，检测sE-selectin水平也可判定脓毒症病变程度和病情，具有十分重要的临床价值。同时，sE-selectin可作为机体炎症反应的标志物之一，本次研究结果显示，脓毒症组sTM从12 h开始逐渐升高，48 h达到高峰；应用LMWH治疗后内的sTM表达含量明显下降，这可能与相关研究认为血清sE-selectin水平可反映血管内皮细胞的活化状态〔10〕，与多种疾病病情的发生、发展有关。

TM作为蛋白C(PC)系统的重要组成部分，具有抗血栓形成、纤溶及抗炎等特性，可改善微循环、减缓器官功能障碍，在脓毒症发病机制中起着重要作用。当内皮细胞受损时，TM脱落进入血液，导致STM升高。本研究表明LMWH可以有效地降低脓毒症内皮细胞的损失，促进血管内皮细胞的改善。

本研究结果表明，LMWH可以减轻脓毒症小鼠的炎症反应，有效地发挥抗血栓、抗凝血及抗炎等作用，通过对脓毒症凝血-炎症网络的调节，从而减轻肺组织炎症损害，且在一定程度上缓解脓毒症的发生发展，提示LMWH具有临床治疗脓毒症、减轻内皮细胞损伤的应用潜力。但血管内皮细胞与其他炎症细胞在发生脓毒症中的关系还有待于进一步研究。

4参考文献

1Vincent JL，Sakr Y，Sprung CL，etal.Sepsis in European intensive care units：results of the soap study〔J〕.Crit Care Med，2006；34(2)：344-53.

2张治云，凌沛学，王凤山，等.低分子肝素药理作用研究进展〔J〕.食品与药品，2006;8(1A)：7-9.

3Chaudry IH，Wichterman KA，Baue AE.Effect of sepsis on tissue adenine nucleotide levels〔J〕.Surgery，1979;85(2)：205-11.

4Bauer I，Bauer M，Raddatz A，etal.Influence of gender on stimulated cytokine response in patients with severe sepsis〔J〕.Anaesthesist，2006;55(5)：515-27.

5Cornet AD，Smit EG，Beishuizen A，etal.The role of heparin and allied compounds in the treatment of sepsis〔J〕.Thromb Haemost，2007;98(3)：579-86.

6李晓祥，李耐三.低分子量肝素的抗血栓作用〔J〕.药学进展，1994;18(1)：6-10.

7安宁飞，刘玉兰.低分子肝素的抗血栓作用〔J〕.沈阳药科大学学报，2000;17(2)：136-9.

8曹苹，张麟生.低分子肝素的抗凝与抗血栓作用〔J〕.中国医院药学杂志，2001;21(5)：289-91.

9Brodt P，Fallavollita L，Bresalier RS，etal.Liver endothelial E-selectin mediates carcinoma cell adhesion and promotes liver metastasis〔J〕.Int J Cancer，1997;71(4)：612-9.

10岳志勇，时光刚.鼻窦癌患者血浆可溶性E-选择素的含量及意义〔J〕.中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，2002;10(3)：123-4.

〔2014-11-19修回〕

(编辑袁左鸣)