柴胡皂苷A对抑郁模型大鼠海马神经细胞凋亡的保护作用

柴胡皂苷A对抑郁模型大鼠海马神经细胞凋亡的保护作用

董海影张静艳柏青杨王绍清张晓杰

(齐齐哈尔医学院病理学系，黑龙江齐齐哈尔161006)

摘要〔〕目的探讨柴胡皂苷A对抑郁模型大鼠海马神经细胞凋亡的保护作用及机制。方法60只SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型组、西药组、中药组；采用慢性不可预见性应激刺激结合孤养方式建立抑郁模型；利用敞箱实验与糖水偏爱度检测大鼠行为学改变；采用电镜观察大鼠脑海马区超微结构变化；应用免疫组化与RT-PCR检测大鼠海马区脑源性神经生长因子(BDNF)蛋白及基因的表达水平。结果与正常对照组相比，模型组水平运动得分、垂直运动得分和糖水偏爱度明显降低(P<0.01，P<0.001)，与模型组比较，西药组和中药组水平运动得分、垂直运动得分和糖水偏爱度均明显升高(P<0.05，P<0.001)；与正常对照组相比，模型组大鼠海马区BDNF mRNA与蛋白表达明显下调(P<0.05)，与模型组相比，西药组、中药组海马区BDNF mRNA与蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论柴胡皂苷A抗抑郁症的作用机制可能与其促进海马区BDNF蛋白与mRNA的活性和表达，进而减少神经细胞凋亡有关。

关键词〔〕柴胡皂苷A；抑郁症；脑源性神经生长因子；细胞凋亡

中图分类号〔〕R749.4〔文献标识码〕A〔

基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12521624)

通讯作者：张晓杰(1965-)，女，教授，硕士生导师，博士，主要从事神经精神疾病的病理学研究。

第一作者：董海影(1982-)，女，讲师，硕士，主要从事神经精神疾病的病理学研究。

世界卫生组织(WHO)最新统计抑郁症全球患病率约11%，并预测2020年抑郁症将成为全球第二位医疗疾患〔1〕。现有抗抑郁症药主要包括单胺氧化酶抑制剂〔2〕、三环类抗抑郁药〔3〕和选择性5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素(NE)再摄取抑制剂〔4〕。这些药物的疗效一般只有60%～70%，并且伴有许多副作用，临床应用受到一定的局限〔5〕。因此，积极寻找特效、低毒、易透过血脑屏障的抑郁症治疗药物成为当今我国乃至世界面临的紧迫任务之一。柴胡是临床上对抑郁症治疗应用广泛且疗效较好的药物之一，柴胡皂苷A是其主要有效成分。本研究探讨柴胡皂苷A的抗抑郁症作用。

1材料与仪器

1.1实验动物4~5月龄清洁级SD雄性大鼠60只，体重200～220 g，由大连医科大学实验动物中心提供，许可证编号：SCXK(辽)2008-0002。

1.2试剂与药品AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒由美国BIPE公司提供；柴胡皂苷A由南京朗泽医药科技公司提供；盐酸氟西汀由中美合资中化药品工业有限公司提供；SP免疫组化染色试剂盒由武汉博士德生物工程科技公司提供。

1.3仪器Medima-chine流式单细胞制备仪(美国BD公司)，FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)，EM208S透射电子显微镜(荷兰菲利浦公司)。

1.4方法

1.4.1动物分组动物购回后在安静、温暖(18℃～20℃)、通风良好、无噪音和自然光照的环境中喂养1 w。通过敞箱实验将水平运动次数加垂直运动次数不足30次或超过120次的大鼠剔除，随机分为正常对照组、模型组、西药组和中药组共4组，每组15只。

1.4.2造模方法模型组、西药组和中药组单笼饲养，同时进行21 d的慢性轻度不可预见性应激刺激：电击足底(电流强度1 mA，电压45 mV，持续时间10 s/次，共30次)、摇晃(1次/s,15 min)、冰水游泳(4℃,5 min)、热应激(45℃,5 min)、夹尾(3 min)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、束缚(8 h)、昼夜颠倒、倾斜鼠笼与潮湿垫料(100 g垫料中加入200 ml水)。每天随机安排1种刺激方式，每种刺激在实验过程中使用不超过3次。正常对照组大鼠不予任何刺激。

1.4.3给药方法造模同时，中药组按25 mg·kg-1·d-1灌胃给予柴胡皂苷，1次/d，连续21 d。西药组按1.2 mg·kg-1·d-1灌胃给予氟西汀，每日1次，共21 d。

1.4.4抑郁模型大鼠行为学评价Open-field测定方法：实验装置为高40 cm、底边长80 cm、周壁涂黑、底板白色的无盖方箱，底板用黑线划成16 cm×16 cm的25个方格。每只动物单独进行测定，每次测定时间为3 min，两只动物之间用体积分数为10%的酒精清洗方箱周壁及底板。计分方法：将大鼠轻放于方箱底板中心，以大鼠穿越底面格数为水平活动得分，大鼠3只脚以上均在同一格子内为一格，穿越一格计1分，如大鼠沿线行走，以每10 cm为1分；以大鼠直立次数为垂直活动得分，双足离开底面为标志。糖水偏爱度的测定：24 h的禁食禁水后，测定1 h动物饮用1%蔗糖水和纯水的量，然后应用公式：1%蔗糖水消耗量/(1%蔗糖水消耗量+纯水消耗量)×100%，计算出各组大鼠糖水偏爱度值。

1.4.5免疫组化法测定大鼠海马区脑源性神经生长因子(BDNF)的蛋白表达大鼠灌注固定，断头取脑，分离海马，固定，包埋，切片，加抗体，显色，复染，脱水，封片，光镜下观察并用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统计算积分光密度。

1.4.6RT-PCR检测BDNF mRNA分离海马，提取RNA，检测RNA纯度及完整性。使用Sequence Detection software version 1.2.3软件分析各标本的的循环阈值(Cycle threshold，Ct值)。采用ΔCt法计算实验结果，以2-ΔCt为 mRNA 的相对浓度，实验组与对照组 mRNA 相对浓度的比值为实验组mRNA表达相对于对照组的倍数。BDNF引物正义链：5′-CCCTTCTACACTTTACCTCTTG-3′，反义链：5′-GTTTCACCCTTTCCACTCCTA-3′。

1.4.7大鼠海马神经元形态超微结构的观察大鼠断头取脑，以0.1 mol/L的PBS冲洗，10%锇酸4℃冰箱后固定2 h，丙酮梯度脱水后丙酮+包埋剂(1∶1)浸透2 h，环氧树脂包埋3 h，聚合37℃，12 h；45℃，22 h；60℃，16 h使之聚合硬化，切片，染色，观察。

1.4.8大鼠海马神经元凋亡的检测大鼠脑海马组织剪碎，制成细胞悬液，经0.7 μm，200目规格的滤网过滤到离心管中，离心，去上清。加入缓冲液重新悬浮细胞，调细胞浓度约1×106个/ml，用冰冻的PBS冲洗1次，离心，去上清。加入10 μl的AnnexinV-FITC和5 μl的Propidium Iodide，轻轻摇匀，室温避光孵育15 min。加入400 μl上样缓冲液液后，立即上流式细胞仪测定。

1.5统计学方法采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1各组大鼠行为学评价结果见表1~表3。与正常对照组相比，模型组水平运动得分、垂直运动得分和糖水偏爱度明显降低(P<0.01,P<0.001),与模型组比较，西药组和中药组上述指标明显升高(P<0.05;P<0.001)。

2.2柴胡皂苷A对大鼠海马区BDNF蛋白与mRNA表达的影响见表4，图1。与正常对照组比较，模型组大鼠海马区BDNF mRNA及蛋白表达明显下调(P<0.05)，与模型组比较，西药组、中药组海马区BDNF mRNA及与蛋白表达明显上调(P<0.05)。

表1　各组大鼠Open-Field实验水平运动

与正常对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001；与模型组比较：4)P<0.05,5)P<0.01，6)P<0.001，下表同

表2　各组大鼠Open-Field实验垂直运动

表3　各组大鼠糖水偏爱度实验数值比较 ± s,%， n=6)

与正常对照组比较：1)P<0.01，2)P<0.001；与模型组比较：3)P<0.01

表4　各组大鼠海马区BDNF表达比较

与模型组比较：1)P<0.05；与西药组比较：2)P<0.05

正常对照组

模型组

西药组

中药组

2.3柴胡皂苷A对大鼠海马超微结构的影响电镜下正常对照组神经元胞核卵圆形，核膜清晰，核染色质均匀，细胞器丰富；模型组神经元胞体变小，胞核呈现皱缩改变，核膜凹凸不整，模糊不清，核染色质增多，块状向边缘聚集，胞质内线粒体肿胀，空泡样，可见大量脂褐素；西药组神经元核仁明显，细胞器丰富，游离核蛋白体非常丰富，偶见脂褐素；中药组神经元胞体基本正常，核内异染色质减少，核周间隙基本正常，高尔基体，粗面内质网正常。见图2。

正常对照组(×40 000)

模型组(×20 000)

西药组(×25 000)

中药组(×25 000)

3讨论

近年来抑郁症病因学研究最具突破性的进展之一是“抑郁症海马神经元再生障碍假说”的提出〔6〕，该假说认为抑郁症的发生与神经系统可塑性失调密切相关，具体表现为神经损伤与神经发生障碍。海马是脑内重要边缘系统结构之一，对应激反应非常敏感且易损伤，参与应激的神经内分泌反应和情绪调节。神经病理学研究显示，抑郁症的病因与海马区域神经细胞的萎缩和坏死有关〔7〕，从而证实抑郁症的发病与海马结构关系密切。BDNF是神经营养因子家庭中的重要成员之一，广泛分布于哺乳类动物的中枢神经系统内，尤以海马、皮层、杏仁核含量最高〔8〕，为公认的神经可塑性的分子标记物。BDNF对多种类型的神经元具有分化、增殖、营养、成熟的作用，尤其与多巴胺、胆碱能、5-HT神经元的可塑性密切相关〔9〕。动物实验发现应激和糖皮质激素导致慢性应激抑郁症时海马BDNF表达下调，而BDNF对突触有支持作用〔10〕。国内外一些研究发现〔11〕，抑郁症患者血清BDNF水平较正常对照者低，且与抑郁程度、病程呈负相关，经抗抑郁治疗后血清BDNF水平上升，并且抑郁症患者血清BDNF水平与病程及严重程度呈负相关。

中药在治疗情志性疾病方面有自己独特的理论体系，也积累了不少临床上有效的方药。中医认为，抑郁症是由于情志不畅、气机郁滞所引起的一类病症。凡具有外感邪气而内著血脉或情致佛郁而内着脏腑，以致气机阻滞，进而诱发痰结、血瘀、火郁等症者，多属“郁症”的范畴。本研究选取了针对抑郁症发病的关键病机“肝郁气滞”，选用了具有“疏肝解郁”作用的要药柴胡，提取出它的主要有效成分柴胡皂苷进行抗抑郁作用的研究。本实验结果显示，柴胡皂苷可能通过调控BDNF，从而拮抗抑郁症模型大鼠海马神经元凋亡，这可能是柴胡皂苷治疗抑郁症的机制之一，但其抗抑郁症的具体机制还有待于进一步研究。

参考文献4

1Kendler KS，Gardner CO.Dependent stressful life events and prior depressive episodes in the prediction of major depression：the problem of causal inference in psychiatric epidemiology〔J〕.Arch Gen Psychiatry，2010；67(11)：1120-37.

2Adli M，Pilhatsch M，Bauer M，etal.Safety of high-intensity treatment with the irreversible monoamine oxidase inhibitor tranylcypromine in patients with treatment-resistant depression〔J〕.Pharmacopsychiatry，2008；41(6):252-7.

3Van Reedt Dortland AK，Giltay EJ，van Veen T，etal.Metabolic syndrome abnormalities are associated with severity of anxiety and depression and with tricyclic antidepressant use〔J〕.Acta Psychiatr Scand，2010；122(1):30-9.

4Andre K，Kampman O，Setälä-Soikkeli E，etal.Temperament profiles，5-HT2A genotype，and response to treatment with SSRIs in major depression〔J〕.J Neural Transm，2010；117(12):1431-4.

5Sanford M，Boyle M，McCleary L，etal.A pilot study of adjunctive family psychoeducation in adolescent major depression：feasibility and treatment effect〔J〕.J Am Acad Child Adolesc Psychiatry，2006；45(4):386-95.

6Thomas RM，Peterson DA.A neurogenic theory of depression gains momentum〔J〕.Mol Interv，2003；3(8):441-4.

7McEwen BS.Plasticity of the hippocampus：adaptation to chronic stress and allostatic load〔J〕.Ann NY Acad Sci，2001；933(3):265-77.

8You J，Yuan Y，Zhang Z，etal.A preliminary association study between brain-derived neurotrophic factor (BDNF) haplotype and late-onset depression in mainland Chinese〔J〕.J Affect Disord，2010；120(1-3):165-9.

9Cheeran B，Talelli P，Mori F，etal.A common polymorphism in the brain-derived neurotrophic factor gene (BDNF) modulates human cortical plasticity and the response to rTMS〔J〕.J Physiol，2008；586(Pt 23):5717-25.

10Gómez-Casati ME，Murtie JC，Rio C，etal.Nonneuronal cells regulate synapse formation in the vestibular sensory epithelium via erbB-dependent BDNF expression〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2010；107(39):17005-10.

11Neumeister A.Tryptophandepletion,serotonin and depression:where do we stand〔J〕.Psyhopharmacol Bulletin，2003；37(4):99-115.

〔2013-09-15修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)