鞘内注射右美托咪定对骨癌痛大鼠脊髓小胶质细胞活化及Toll样受体的影响

鞘内注射右美托咪定对骨癌痛大鼠脊髓小胶质细胞活化及Toll样受体的影响

孟根其其格罗建军张毅1

(北京市东城区第一人民医院麻醉科，北京100075)

摘要〔〕目的探讨鞘内注射右美托咪定(DEX)对骨癌痛大鼠脊髓小胶质细胞活化的影响。方法通过向健康雄性SD大鼠(200～250 g)胫骨骨髓腔内注射Walker256乳腺癌细胞液制备骨癌痛(BCP)模型后进行鞘内置管，将45只成功诱导BCP大鼠模型随机分组(n=15)：高剂量DEX(DEX-H)组、低剂量DEX(DEX-L)组及生理盐水(NS)组，DEX-H与DEX-L组分别于鞘内注入6 μg·kg-1·d-1或3 μg·kg-1·d-1(注射体积均为10 μl)，同时选取15只同周龄大鼠作对照(C)，其余两组鞘内注入等体积生理盐水。于鞘内注射前后对4组进行行为学检测来分析DEX对BCP大鼠机械缩足阈值(MWT)和缩足热潜伏期(WTL)的影响，采用荧光免疫组化法检测各组鞘内注射7 d后的脊髓小胶质细胞特异表达补体C3受体(OX-42)的荧光积分光密度(IOD)，酶联免疫吸附法检测脊髓肿瘤坏死因子(TNF)-α和白介素(IL)-1β水平，免疫印迹检测脊髓Toll样受体(TLR)4及TLR2蛋白水平。结果与C组相比，NS组鞘内注射0~7d的NMT和WTL降低，脊髓小胶质细胞OX-42的IOD、脊髓TNF-α和IL-1β水平及Toll样受体表达均升高(P<0.05)；给予DEX鞘内注射可改善BCP大鼠的以上异常指标(P<0.05)，但与C组均有统计学差异(P<0.05)；且DEX-H组的以上指标均优于DEX-L组(P<0.05)。结论鞘内注射DEX对BCP大鼠有较好的镇痛作用并抑制了脊髓小胶质细胞活化，可能与其缓解炎症反应及降低Toll样受体表达有关。

关键词〔〕右美托咪定；骨癌痛；镇痛；脊髓小胶质细胞活化

中图分类号〔〕R73〔文献标识码〕A〔

1新疆医科大学附属中医医院手术麻醉科

第一作者：孟根其其格(1979-)，女，主治医师，主要从事老年麻醉、骨科麻醉研究。

骨转移癌会引起中重度骨痛，严重影响生活质量，同时也会导致患者体能状态下降及焦虑或抑郁发生〔1〕。目前，疼痛治疗的重点已转移至神经胶质细胞，且已证实神经胶质细胞参与病理性疼痛的发生发展〔2〕。疼痛时，处于静息状态的小胶质细胞被活化，因此抑制神经小胶质细胞活化成为疼痛治疗的有效措施〔3〕。右美托咪啶(DEX)为一种α2肾上腺素能受体激动剂，具有高选择性、高效的优点，可起到镇静催眠、镇痛及抑制交感神经活动的作用，且不良反应低，在临床应用较广〔4，5〕。笔者推测DEX对骨癌痛亦有较好的镇痛作用。鉴于鞘内注射是临床治疗疼痛的常用手段，故本研究给予骨癌痛大鼠模型鞘内注射DEX，观察对小胶质细胞活化的影响。

1材料与方法

1.1试剂与主要仪器DEX由于江苏新晨制药有限公司提供；Walker256乳腺癌细胞购自上海生物医学工程研究院；二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析试剂盒购自碧云天生物科技公司；Triton X-100、苯甲基黄酰氟及Tris-HCl及购自美国Sigma公司；白介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)α检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；羊抗特异表达补体C3受体(OX-42)抗体购自美国Abcam公司，兔抗Toll样受体(TLR)4及TLR2抗体均购自美国Santa Cruz公司；红色标记的二抗购自上海亨代劳生物有限公司。仪器：Multiskan Ascent酶标仪购自Thermo公司；5424R小型台式冷冻离心机、移液枪均购自德国Eppendorf公司；全自动热辐射刺激仪购自中国科学院生物医学工程研究所；Mini Protean 3 Cell小型垂直电泳槽购自美国Bio-Rad公司。

1.2动物与分组通过向健康雄性SD大鼠(200～250 g)胫骨骨髓腔内注射Walker256乳腺癌细胞液制备骨癌痛(BCP)模型后进行鞘内置管，将45只成功诱导BCP大鼠模型随机分组(n=15)：高剂量DEX(DEX-H)组、低剂量DEX(DEX-L)组及生理盐水(NS)组，DEX-H与DEX-L组分别于鞘内注入6、3 μg·kg-1·d-1(注射体积均为10 μl)，同时选取15只同周龄大鼠作对照(C)，其余两组鞘内注入等体积生理盐水。

1.3BCP模型制备及鞘内置管根据文献〔6〕制备BCP模型：给予BCP大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)，待大鼠充分麻醉后，取仰卧位后对左后肢进行消毒备皮，采用手术刀切开皮肤，分离肌肉筋膜充分暴露胫骨，于胫骨结节下外0.5~1 cm的胫骨平台位置，采用微量注射器抽取Walker256乳腺癌细胞液，向骨髓腔注射10 μl细胞液，用骨蜡封住针孔并缝合。待BCP制备后5 d根据Sluka等〔7〕的方法进行鞘内置管：切开枕部皮肤后，22G无菌注射器枕头刺破寰枕膜，待脑脊液流出后置入PE-10导管，固定好导管后缝合皮肤。术后肌注青霉素预防感染。

1.4行为学评价分别于鞘内注射前、鞘内注射不同时间点(1、3、5、7 d)后进行行为学检测，分析DEX鞘内注射对机械缩足阈值(MWT)和缩足热潜伏期(WTL)的影响，来评价其镇痛效果。MWT：采用不同折力(1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0 g)Von Frey纤维刺激足底中部，每次刺激6~8 s，每次刺激间隔1 min，当大鼠出现快速缩足或舔足，则定义为阳性反应，重复5次，3次以上阳性反应的最小刺激力度计为MWT。WTL：采用全自动热辐射刺激仪照射足底，每次照射不超过25s，每次重复3次，间隔5 min，3次出现抬腿反应的时间平均值计为WTL。MWT和WTL的数值越小，就表明痛觉越敏感。

1.5荧光免疫组化采用脊髓小胶质细胞特异性标记物OX-42的荧光积分光密度(IOD)值来评价其活化情况。过量麻醉致死后，迅速取出大鼠的L4~6脊髓段，经多聚甲醛固定、蔗糖脱水后，制备厚20 μm的冠状冰冻切片，每隔5张保留1张片子，每隔脊髓样本选取5张用于免疫组化，经H2O2室温孵育及山羊血清封闭后，滴加OX-42的一抗(1∶100)，4℃孵育过夜后，滴加红色标记的二抗，将片子置于荧光显微镜下观察，采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件测定荧光积分光密度(IOD)。

1.6酶联免疫吸附法将新鲜脊髓标本取出后，于冰上进行裂解，以5 000 r/min离心5 min后保留上清，采用对应试剂盒检测脊髓提取液中的TNF-α、IL-1β含量，以上操作均严格遵守试剂盒说明书。

1.7免疫印迹BCA法检测脊髓提取液中的蛋白浓度，每个样本取等量蛋白，与上样缓冲液混匀、煮沸，上样后行10% SDS-PAGE凝胶电泳，半干转法将电泳条带转移至硝酸纤维素膜，脱脂奶粉封闭后，根据膜面积加入TLR-2(1∶100)、TLR-4(1∶200)一抗，4℃孵育过夜，次日加入二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，以GAPDH为内参(1∶3 000)，ECL化学发光法显影，采用Image Pro Plus 6.0软件分析各条带光密度，结果表示为目的条带与内参的光密度比值。

1.8统计学分析采用SPSS16.0软件，组间比较采用t检验及单因素分析。

2结果

2.1鞘内注射DEX对MWT的影响与C组比较，NS组鞘内注射0~7 d的NMT水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；给予DEX鞘内注射可升高BCP大鼠模型的MWT(P<0.05)，但与C组的差异仍有统计学意义(P<0.05)；DEX-H组鞘内注射1~7 d的NMT水平均高于DEX-L组(P<0.05)。见图1A。

2.2鞘内注射DEX对WTL的影响与C组比较，NS组鞘内注射0~7 d的WTL水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；给予DEX鞘内注射可升高BCP大鼠模型的WTL(P<0.05)，但与C组的差异仍有统计学意义(P<0.05)；DEX-H组鞘内注射1~7 d的WTL水平均高于DEX-L组(P<0.05)。见图1B。

2.3鞘内注射DEX对脊髓小胶质细胞活化的影响NS组鞘内注射7d的小胶质细胞OX-42的IOD为662.8±53.7，高于C组的246.7±21.5，差异有统计学意义(P<0.05)；给予DEX鞘内注射可降低BCP大鼠模型的小胶质细胞OX-42的IOD水平，但与C组的差异仍有统计学意义(P<0.05)；DEX-H组鞘内注射7d的IOD水平为345.9±25.8，低于DEX-L组的492.3±44.2，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.4 鞘内注射DEX对脊髓细胞炎症因子水平的影响与C组比较，NS组鞘内注射7 d后的脊髓TNF-α和IL-1β水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；给予DEX鞘内注射可降低BCP大鼠模型的脊髓TNF-α和IL-1β水平(P<0.05)，但与C组的差异仍有统计学意义(P<0.05)；DEX-H组鞘内注射7 d后的脊髓TNF-α和IL-1β水平均低于DEX-L组(P<0.05)。见表1。

A：MWT；B：WTL；与C组比较：1)P<0.05；与NS组比较：2)P<0.05；与DEX-L组比较：3)P<0.05 图1　鞘内注射DEX对MWT和WTL的影响

图2　鞘内注射DEX对脊髓小胶质细胞OX-42的IOD影响(×400)

2.5鞘内注射DEX对脊髓Toll样受体表达的影响与C组比较，NS组鞘内注射7d后的脊髓TLR-2和TLR-4蛋白水平升高(P<0.05)；给予DEX鞘内注射可降低BCP大鼠模型的脊髓TLR-2和TLR-4水平(P<0.05)，但与C组的差异仍有统计学意义(P<0.05)；DEX-H组鞘内注射7 d后的脊髓TLR-2和TLR-4水平均低于DEX-L组(P<0.05)。见图3，表2。

表1　鞘内注射DEX对脊髓细胞炎症因子水平的

与C组比较：1)P<0.05；与NS组比较：2)P<0.05；与DEX-L组比较：3)P<0.05；下表同

图3　鞘内注射DEX对脊髓Toll样受体表达的影响

组别TLR2TLR4C组0.18±0.050.22±0.03NS组0.57±0.031)0.74±0.051)DEX-L组0.39±0.061)2)0.45±0.041)2)DEX-H组0.25±0.021)2)3)0.36±0.041)2)3)

3讨论

骨癌痛是一种中重度病理性疼痛，严重影响患者生活质量。为研究鞘内注射DEX对骨癌痛有无改善作用，本研究采用公认的动物模型，即通过采用Walker256乳腺癌细胞向胫骨上段骨髓腔内注射来制备BCP模型。大鼠在骨髓腔内接种乳腺癌细胞后会引起骨破坏，主要表现为骨皮质和骨小梁损伤，尤其在接种12 d后会胫骨骨髓腔会出现大规模肿瘤细胞浸润〔8〕。本研究根据相关文献报告于BCP模型制备10 d后进行鞘内注射治疗，同时为研究DEX对癌痛的治疗效果，本研究采用两个剂量研究鞘内注射DEX对骨癌痛大鼠脊髓小胶质细胞活化的影响。

本研究发现：BCP模型建立后，大鼠的疼痛阈值降低，主要表现为MWT和WTL水平均升高，提示BCP模型建议成功，且在为期7 d的治疗中，NS组的MWT和WTL水平均维持在一个稳定水平，提示该种模型的疼痛状态较为稳定，不会通过机体的代偿而缓解或恢复，可更好地研究DEX的镇痛效果。给予DEX鞘内注射后发现，治疗1 d后MWT和WTL水平即升高，差异有统计学意义，以上表明DEX对BCP疼痛有改善效果，且改善效果可持续7 d。

目前，小胶质细胞已成为疼痛干预的重点，约占神经胶质细胞的5%~10%，在正常情况下为静息状态，但外界刺激可引起小胶质细胞激活，如参与术后持续性疼痛形成及神经病理性疼痛有关〔9，10〕。小胶质细胞，由脊髓单核细胞分化而来，当其活化时，其主要表面抗原物质OX-42会大量表达〔11〕，故本研究采用荧光免疫组化法检测OX-42的IOD评价小胶质细胞的激活情况。本研究发现：NS组的IOD值高于C组，提示BCP大鼠的小胶质细胞处于活化状态，与癌细胞浸润引起的疼痛有关，而DEX鞘内注射后IOD降低，提示DEX可抑制小胶质细胞活化，为其镇痛的主要原因。疼痛可引起炎症反应，尤其当小胶质细胞处于活化状态时〔12〕，本研究中BCP大鼠的脊髓常见炎症因子TNF-α和IL-1β水平升高，而给予DEX鞘内注射后，以上炎症因子水平降低，表明DEX可缓解炎症反应。Toll样受体介导了炎症反应〔13〕，而本研究发现BCP大鼠的TLR-2和TLR-4水平均升高，更加证实了癌痛大鼠出现了炎症反应，而给予DEX后两者水平下调，与其改善炎症反应的结论一致。

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〔2014-07-20修回〕

(编辑滕欣航)