水通道蛋白-4在抑郁及抗抑郁大鼠模型海马区的表达

水通道蛋白-4在抑郁及抗抑郁大鼠模型海马区的表达

任爱华王海鹏赵华1何欣

(北华大学医学院，吉林吉林132000)

摘要〔〕目的探讨抑郁及抗抑郁模型大鼠海马区水通道蛋白(AQP)-4的表达。方法通过采用慢性不可预见性刺激和孤养相结合的方法，在应激第21天后对大鼠称量体重、测24 h糖摄取量，灌流取脑，免疫组化观察海马区AQP-4的变化。结果抑郁大鼠体重和糖摄取量明显少于正常对照组及抗抑郁组，抑郁模型大鼠海马区神经元出现凋亡及AQP-4表达增加。结论AQP-4在抑郁模型大鼠脑中对抑郁症的发病发挥重要作用。

关键词〔〕抑郁症；海马；慢性应激；水通道蛋白-4

中图分类号〔〕R74〔文献标识码〕A〔

通讯作者：何欣(1957-)，男，教授，硕士生导师，主要从事神经解剖学研究。

1吉林大学基础医学院

第一作者：任爱华(1976-)，男，硕士，讲师，主要从事神经解剖学研究。

抑郁症(DEP)是在持续困境的作用下，可引发精神障碍，日益受到全社会的普遍关注并成为研究的热点〔1〕。本实验采用不可预知的长期温和应激刺激(CUMS)和分养2种经典模型相结合的方式制造抑郁模型〔2〕。以往研究〔3~5〕表明抑郁模型大鼠海马区锥体细胞和颗粒细胞再生减少和萎缩。但目前国内外对于抑郁患者发病机制不能完全统一，本实验在形态学上揭示CUMS模型大鼠海马区水通道蛋白(AQP)-4表达的改变，来分析神经元凋亡的原因及机制。

1材料和方法

1.1动物、仪器及试剂采用吉林大学试验动物研制中心提供的清洁级Wistar雄性大鼠27只，体重180~190 g，清洁级动物饲料喂养，饲养环境清洁且有昼夜光线变化适应1 w。电刺激器(蚌埠第二仪器厂)；Tiger 2000图像分析仪(重庆大学软件研究所)；Nikon 数码照相机(日本)。S-P试剂盒(福州迈新公司提供)；兔抗AQP-4抗体，由吉林大学病理生理教研室赠送。氟西汀常州第四制药厂。

1.2方法

1.2.1动物模型建立、观察及分组随机分为正常对照组、抑郁模型组和给药组大鼠各9只。制备抑郁动物模型的方法：每天随机实施一种不同的应激刺激，包括足底电击、热、禁食禁水、疼痛、饥渴、冰水游泳等，持续21 d。正常对照组不接受刺激。给药组给予氟西汀治疗，量为10 mg/kg,1次/d,皮下注射,共4 w。在第22天对各组进行称量体重及记录第22天24 h内大鼠蔗糖摄取量〔6〕，在应激前后都用open- field法进行行为评分〔7〕。

1.2.2脑组织取材、固定、切片及表片在第22天两组大鼠分别用10%水合氯醛行腹腔内注射麻醉后，在心尖部注射50 U/100 g的肝素抗凝，用200 ml生理盐水快速灌注，然后用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液灌注，开颅取脑组织于后固定液(4%多聚甲醛溶液)24 h，行石蜡包埋。连续冠状切片，片厚6 μm，隔5取1片，表片，贴片分成3套，56℃恒温箱干燥。一套用来观察核团部位，一套行AQP-4免疫组化染色，一套备用。

1.2.3SP法免疫组织化学染色常规脱蜡、脱水，抗原修复，玻片上滴加过氧化氢溶液(SP试剂盒中试剂A)，室温下于湿盒中孵育20 min，以阻断内源性过氧化物酶的作用。0.01 mol/L PBS冲洗，5 min，3次。滴加非免疫动物血清(SP试剂盒中试剂B)，室温下于湿盒中孵育20 min以减少非特异性免疫结合反应。0.01 mol/L PBS冲洗，5 min，3次。滴加兔抗大鼠AQP-4工作浓度为1∶50，4℃过夜，0.01 mol/L PBS冲洗，5 min，3次。滴加生物素标记羊抗兔(SP试剂盒中试剂C)，室温下于湿盒中孵育20 min，0.01 mol/L冲洗，5 min，3次。滴加链霉素生物素蛋白-过氧化物酶溶液(SP试剂盒中试剂D)，室温下于湿盒中孵育20 min，0.01 mol/L PBS冲洗，5 min×3次。滴加新配制的二甲基联苯胺(DAB)显色剂。苏木素复染。80%、90%乙醇、无水乙醇各3 min脱水。二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min透明。中性树胶封片。阴性对照采用替代实验，即用PBS代替一抗来孵育切片，其他步骤相同。

1.2.4AQP-4阳性细胞的计数方法阳性神经元的形态学观察及测定，于OLYMPUS显微镜下，放大400倍，确定海马内AQP-4阳性神经细胞的形态及分布。免疫组化染色:染色强度以多数细胞为准，染色阴性为(-)，染色呈淡棕黄色为(+)，深棕黄色为()，深棕褐色为()。图像分析仪处理:先在每张免疫组化染色切片上，取空白区，测定背景的灰度值。随机取20个阳性细胞，用鼠标描绘所测细胞的胞膜区域，计算机自动测量灰度。减去背景值再除以20，获得该切片阳性细胞的平均灰度值。

2结果

2.1应激对大鼠行为的影响随应激时间的增加，应激大鼠逐渐出现行动迟缓、活动减少，食欲不振、对环境变化失去兴趣。在第22天时，观察大鼠的水平运动、垂直运动及理毛时间及排便次数与正常对照组相比都明显减少(P<0.01)。见表1。

表1　应激及药物治疗对大鼠open-field行为的影响

与正常对照组第22天比较：1)P<0.01，2)P<0.05；与模型组第22天比较：3)P<0.01，4)P<0.05

2.2应激对大鼠蔗糖摄取量及体重的影响 在应激第22天后，模型组蔗糖摄取量〔(0.25±3.99)ml〕及平均体重〔(204.17±9.75)g〕与正常对照组〔(19±3.7)ml,(263.33±16.43)g〕及给药组〔(17.14±4.15)ml,(251.66±15.22)g〕大鼠比较明显降低(P<0.05)。

2.3应激对大鼠海马AQP-4免疫组化染色的影响正常对照组大鼠可见海马和齿状回各层中，最明显的是胞体较大的呈三角形的锥体细胞层和胞体呈圆形或卵圆形的颗粒细胞层，其排列紧密、规则，细胞核清晰可见，胞膜连续完整，神经元排列层次整齐未见神经元细胞核固缩和空泡现象。模型组大鼠海马各区神经元颗粒细胞层较正常对照组和给药组明显减少，且锥体细胞层和颗粒细胞层的神经元排列疏松、散乱，尤其在抑郁组海马的CA1、CA3、齿状回神经元细胞减少，较多的神经细胞出现空泡和核固缩，部分细胞的脱落形成了空泡。在海马各区神经元中，以齿状回神经元减少最多，其次为CA1区。AQP-4在大鼠海马CA1、CA3、齿状回各区都可以见到，主要局限在星形胶质细胞结构特点的胶质细胞和室管膜细胞亚群，在血管的周围胶质细胞的足突呈现强烈的标记，呈深棕色，海马的锥体细胞层、齿状回颗粒细胞层和多形细胞层上有的表达，呈棕黄色。抑郁模型组较正常对照组和给药组海马区齿状回表达较多，在CA1、CA3区也明显增多，见图1。与正常对照组平均灰度值19.18±2.31相比，模型组大鼠海马AQP-4平均灰度值显著升高〔(31.12±3.27)，P<0.05〕，给药组为23.22±3.13。

正常对照组

模型组

给药组

3讨论

对于评价一个DEP模型的制作是否成功主要依据动物在行为上的变化〔8〕，本模型中动物经22 d慢性综合性应激后，大鼠活动明显减少；测量在应激结束后大鼠体重及24 h糖摄入量均少与对照组和给药组；发现抑郁模型大鼠海马各区神经元颗粒细胞层减少，且锥体细胞层和颗粒细胞层的神经元排列疏松、散乱。在行为学和形态学上都与国际上诊断抑郁模型标准相一致，表明本实验中大鼠DEP模型的制作是成功的。

AQP4是中枢神经系统表达量最多的一类水通道蛋白，主要富集表达于星形胶质细胞上，调节脑脊液体积，同时参与调节星形胶质细胞的功能〔9〕。目前的观点认为，神经干细胞属于星形胶质细胞家系中成员之一，其表面同样高度表达AQP4〔10〕。AQP4敲除小鼠纹状体，皮层，海马内谷氨酸、单胺类神经递质及其代谢产物的含量明显改变〔11〕。由此可见AQP4调节脑内物质代谢平衡。抗抑郁药治疗能提高脑内血管内皮生长因子(VEGF)的水平，VEGF能促进神经再生，而且阻断VEGF信号通路也能抑制抗抑郁药的促增殖作用〔12〕。 氟西汀是治疗抑郁症的经典药物之一，氟西汀可以逆转应激动物模型海马区的星形胶质细胞数目减少〔13〕，而且对离体培养的神经干细胞有直接的促增殖作用〔14〕。能够促进体外培养的原代星形胶质细胞合成和分泌脑源性神经生长因子(BDNF)，胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)等神经营养因子〔15〕。由以上可以看出AQP-4的这些生理作用对于脑组织维持一个适宜的内环境稳定是非常重要的。在本实验中，AQP-4增加可能由于长期刺激使脑内环境改变，同时参与改善脑内环境。在抑郁模型的大鼠的海马里出现神经元的凋亡，凋亡的细胞释放过多的K+和血糖(GLU)，这些过多的K+和GLU进一步促使AQP-4为维持内环境的平衡稳定而适应性增加，把过多的K+和GLU转运到神经胶质细胞内，从而导致胶质细胞的死亡和数目减少，神经胶质细胞给神经原细胞提供营养，所以进一步加重了海马区神经元的凋亡。而氟西汀能够有效地逆转这种凋亡，是较为肯定的治疗药物。

综上所述，从本实验中我们可以看出来AQP-4既参加调节抑郁模型大鼠海马区内环境，同时对抑郁模型大鼠海马区神经原的凋亡发挥作用。氟西汀治疗抑郁的机制之一是提升大鼠海马区5-HT浓度，进而影响AQP-4的表达，达到抗抑郁的作用，所以AQP-4既有正面积极的作用，也有负面影响，这为以后在抑郁症发病机制的研究中提供了新的方向。

参考文献4

1Balasinorwala VP，Shah N.Acute stress disorder in victims after terror attacks in Mumbai，India〔J〕.Br J Psychiatry,2009；195(5)：462.

2Willner P.Animal models as stimulations depression〔J〕.Trends Pharmacol Sci,1991；12(4):131.

3Mcewen BS.Stress and hippocampcal plasticity〔J〕.Annu REV Neurosci,1999；22:105-22.

4Gould E,Tanapat P.Stress and hippocampal neurogenesis〔J〕.Biol Psych,1999；46(11):1472-9.

5Mcewen BS.Effects of adverse experiences for brain structure and function〔J〕.Biolpsychiatry,2000；48(8):721-31.

6StrekalovaT，Gorenkova N，Schunk E，etal.Selective effects of citalopram in a mouse model of stress-induced anhedonia with a control for chronic stress〔J〕.Behav Pharnlacol，2006;17(3):271-87.

7徐淑云，卞如濂，陈修.药理实验方法学〔M〕.北京：人民卫生出版，1991：643.

8Willer P.Animal models as stimulations of depression〔J〕.TIPS，1991；12:131-6.

9Saadoun S，Papadopoulos MC，Watanabe H，etal.Involvement of aquaporin-4 in astroglia cell migration and glial scar formation〔J〕.J Cell Sci，2005；118(Pt 24)：5691-8.

10LaPorta CA，Gena P，Gritti A，etal.Adult murine CNS stem cells express aquaporin channels〔J〕.Biol Cell，2006；98(2):89-94.

11Fan Y，Zhang J，Sun XL，etal.Sex-and region-specific alterations of basal amino acid and monoamine metabolism in the brain of aquaporin-4 knockout mice〔J〕.J Neurosci Res，2005；82(4):458-64.

12Warner-Schmidt JL，Duman RS.VEGF is an essential mediator of the neurogenic and behavior alactions of antidepressants〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2007;104(11):4647-52.

13Czeh B，Simon M，Schmelting B，etal.Astroglial plasticity in the hippocampus is affected by chronic psychosocial stress and concomitant fluoxetine treatment〔J〕. Neuro Psychol Phannacol，2006;31(8):1616-26.

14Chiou SH， Chen SJ，Peng CH，etal.Fluoxetine up-regulates expression of cellular FLICE-inhibitory protein and inhibits LPS-induced apoptosis in hippocampus-derived neural stem cell〔J〕.Biochem Biophys Res Common，2006;343(2):391-400.

15Mereier G，Lennon AM，Renouf B，etal.MAP kinase activation by fluoxetine and its relation to gene expression in cultured rat astrocytes〔J〕.J Mol Neurosci，2004;24(2):207-16.

〔2013-11-18修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

《中国老年学杂志》郑重声明

中国老年学杂志从未设任何网站，唯一投稿方式为邮箱投稿，投稿邮箱为：okgood911@126.com 。唯一咨询电话：0431-88923384 。唯一汇款方式为邮局汇款，汇款地址：长春市建政路971号《中国老年学杂志》编辑部收，邮编：130061。