补阳还五汤对动脉粥样硬化大鼠细胞间黏附分子-1表达的影响

补阳还五汤对动脉粥样硬化大鼠细胞间黏附分子-1 表达的影响

吕永恒黎洪展肖卫辉吴晓伟陈铁明

(南方医科大学中西医结合医院，广东广州510315)

摘要〔〕目的研究补阳还五汤对动脉粥样硬化(AS)大鼠细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法采用高胆固醇饲料喂饲建立大鼠AS模型并予补阳还五汤干预。测定各组内膜增生情况，免疫组化观察内膜粥样硬化斑块中ICAM-1的表达。结果补阳还五汤组内膜增生较模型组明显减轻(P<0.05)。补阳还五汤组ICAM-1表达较模型组明显减少(P=0.019)。结论补阳还五汤能显著改善大鼠AS水平；可明显抑制ICAM-1表达，此可能为其防治AS的机制之一。

关键词〔〕补阳还五汤；动脉粥样硬化；细胞间黏附分子

中图分类号〔〕R285〔文献标识码〕A〔

基金项目：广东省中医药局项目(No.20121122)

通讯作者：黎洪展(1973-)，男，副主任医师，硕士，主要从事心脑血管疾病研究。

第一作者：吕永恒(1971-)，男，副主任医师，硕士，主要从事心血管疾病研究。

研究认为动脉粥样硬化(AS)过程不仅仅是脂质在动脉壁中的聚积，而且是一种慢性炎症性疾病，多种炎性细胞因子的过度释放是其重要机制〔1〕。已有研究发现细胞间黏附分子-1(ICAM-1)参与了AS的形成过程〔2〕。活血、益气、化痰是中医治疗冠心病的常用方法，补阳还五汤是收载于《医林改错》中的经典方剂，具有益气活血、通经活络的功效，已有研究认为补阳还五汤具有抗AS作用〔3〕。本研究探讨补阳还五汤对试验性大鼠AS形成及主动脉ICAM-1表达的影响。

1材料和方法

1.1 主要试剂和仪器ICAM-1单克隆抗体购自武汉博士德生物工程公司；即用型SABC免疫组化试剂盒(含生物素标记山羊抗兔/大鼠IgG二抗和辣根过氧化物酶标记链霉菌卵白素工作液)和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；荷兰威图全自动生化分析仪；LeicaRM2125切片机和LeicaDME321058943PX显微摄像机由德国徕卡公司生产；OLYMPUSCH20BIMF200-2显微镜由日本奥林巴斯公司生产。

1.2 方法

1.2.1 药物制备补阳还五汤依原方组成，其中黄芪120 g，川芎15 g，当归15 g，赤芍15 g，桃仁12 g，红花12 g，地龙10 g。将上述药物用水煎煮3次，时间分别为1.5 h、1 h和45 min。合并煎煮液后浓缩成含生药相当于2.5 g/ml，分装，-80℃保存备用。

1.2.2 动物分组及给药健康SD雄性大鼠30只，体质量(280±20)g。将大鼠随机分为三组：对照组、模型组、补阳还五汤组，每组10只。大鼠分组后，对照组为普通饮食；模型组、补阳还五汤组饲以高脂饮食参照文献方法造模，其饲料配制是：4%胆固醇、10%猪油、0.2%甲基硫氧嘧啶、86%基础饲料，基础饲料中面粉20%，米粉2%、玉米20%、麸皮25%、豆料20%、骨粉2%、鱼粉2%；补阳还五汤组同时予补阳还五汤煎剂，其中第1～2周通过灌胃给药，以后拌入正常饲料中，每鼠每天经上午、下午两次给药，日总量相当于含生药5 g/kg(相当于体重为70 kg的成人用量)12 w后实验。

1.2.3 主动脉病变病理检查及主动脉内膜增生测定将胸主动脉段血管标本浸入4%多聚甲醛溶液中，固定48 h，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察主动脉病理形态学改变。每片随机取3个视野，用MIASE医学图像分析管理系统测血管内膜厚度、内膜中膜厚度比及内膜面积/(内膜面积+中膜面积)比值即内膜增生指数。

1.2.4 主动脉ICAM-1免疫组织化学染色在胸主动脉中段定位切取2 mm×5 mm组织，制石蜡切片，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每次3 min，按免疫组化试剂盒说明进行免疫组化染色，在显微镜高倍视野下观察分析阳性结果，采用图像分析系统，以阳性表达的百分率半定量分析ICAM-1表达的强弱。

1.3 统计学方法采用SPSS10.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1 主动脉病理学改变肉眼可见对照组内膜光滑，无斑块形成。高脂模型组血管表面不光滑，凹凸不平，大量黄白色斑块突出于管腔表面，并连接成片，尤以近主动脉弓处及血管开口处最为明显。HE 染色可见模型组的内膜显著增厚，内膜不完整，内皮下腔隙增大，内含大量泡沫细胞，中弹力纤维增粗，弹力纤维和胶原纤维排列紊乱。补阳还五汤组主动脉内膜厚度较模型组显著变薄，病理改变减轻，只偶有少量的脂质沉积、散在的泡沫细胞和炎症细胞。与对照组相比，模型组管腔面积减小、新生内膜面积增大、内膜增生百分比增大(P<0.001)。与模型组相比，补阳还五汤组管腔面积增大、新生内膜面积减小、内膜增生百分比减小(P<0.05)。见表1。

2.2 主动脉ICAM-1免疫组化检测ICAM-1在模型组的表达为(3.67±0.43)%，较对照组的(0.55±0.25)%明显增高(F=15.34，P=0.002)，ICAM-1在补阳还五汤组的表达为(1.29±0.52)%，较模型组降低(F=8.69，P=0.019)。见图1。

表1　各组主动脉内膜增生情况比较 ± s, n=10)

1)模型组与对照组比较；2)模型组与补阳还五汤组比较

图1　各组大鼠主动脉ICAM-1的表达(DAB，×200)

3讨论

中医研究认为AS斑块的形成与气虚、血瘀、痰阻密切相关，有黏、浓、凝、聚的特点，以气虚血瘀证型最为常见，益气活血能明显改善临床症状，尤其可以改善高危人群的生活质量，延长生存期，降低致残率和死亡率，因此活血化瘀一直是AS中医药防治研究的热点。中医学界AS的认识与现代医学的免疫炎症机制有一定关联，探讨二者之间的内在联系，可以为中医治疗AS提供思路〔4，5〕。

本文用高脂高胆固醇饲养成功建立了动脉粥样硬化模型，其主要表现为血脂升高，大动脉及冠状动脉内皮下脂质浸润，管腔面积减小、新生内膜面积增大、内膜增生百分比增大等病理改变。加饲补阳还五汤的动物受累血管病变程度轻、管腔面积增大、新生内膜面积减小、内膜增生百分比减小，说明具有补气活血、通经活络功能的补阳还五汤具有抗AS形成的作用。

ICAM-1属于黏附分子免疫球蛋白超家族，广泛分布在体内的各种组织细胞的表面，其中以血管内皮细胞表面的表达最强。正常情况下内皮细胞中的ICAM-1表达很低，在内皮细胞缺血、再灌注损伤情况下，大量炎性递质、细胞因子等能诱导ICAM-1蛋白及mRNA 的表达，参与T细胞反应、促进单核细胞与内皮细胞的黏附等。在动脉粥样硬化形成过程中，首先是血管内皮受损，ICAM-1等表达增加，调节白细胞的黏附及穿越内皮的游移，随后单核细胞到内皮下，摄取氧化修饰低密度脂蛋白，变为激活的巨噬细胞，最终成为泡沫细胞〔6〕。ICAM-1在AS病人的脂纹和纤维斑块中大量表达是AS早期的病理变化及斑块进展的潜在机制，并与AS的严重程度有关〔7〕，ICAM-1不仅有助于斑块的形成，而且同斑块的稳定性有关〔8〕。抑制ICAM-1的表达，可以减轻或延缓AS病变的发生和发展〔9〕。本研究发现，AS模型组主动脉可见大量ICAM-1阳性表达细胞，并且主要表达于病变血管的内皮及斑块中，而补阳还五汤能明显抑制AS大鼠主动脉ICAM-1的表达，从而抑制了AS时炎症细胞趋化、黏附与迁移，抑制AS时局部炎症反应而达到防治AS的作用。

4参考文献

1Montero-Vega MT. The inflammatory process underlying atherosclerosis〔J〕.Crit Rev Immunol,2012;32(5):373-462.

2Pi X,Lockyer P,Dyer LA,etal. Bmper inhibits endothelial expression of inflammatory adhesion molecules and protects against atherosclerosis〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012;32(9):2214-22.

3曾平，符秀琼，王启瑞. 加味补阳还五汤对动脉粥样硬化斑块形成及炎症细胞因子表达谱的影响〔J〕.中药药理与临床，2009;25(6)：11-3.

4金华，金钊，张蕾蕾. 从炎症发病机制探讨急性冠脉综合征的中医治法〔J〕.中国中医基础医学杂志，2006;12(10)：752-4.

5潘莉，张建新，陈玲燕. 补阳还五汤对 2 型糖尿病大鼠模型血清 TNF-α 及肾脏 VCAM-1 表达的影响〔J〕.中国老年学杂志,2011; 31(23):4632-5.

6Calixto JB,Campos MM,Otuki MF,etal. Anti-inflammatory compounds of plant origin〔J〕.Planta Med,2004; 70 (2):9-16.

7梁萍，孙雷，唐建武. 细胞间粘附分子1、血管细胞粘附分子1和肿瘤坏死因子A在人动脉粥样硬化病灶中的表达及意义〔J〕.中国动脉硬化杂志,2004; 12 (4):427-9.

8徐芳，刘颖，季健，等. 载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化早期血管外膜血管细胞黏附分子1和细胞间黏附分子1的表达〔J〕.中国动脉硬化杂志，2010; 18(5)：337-41.

9Sanadgol N,Mostafaie A,Mansouri K,etal. Effect of palmitic acid and linoleic acid on expression of ICAM-1 and VCAM-1 in human bone marrow endothelial cells〔J〕.Arch Med Sci,2012;8(2):192-8.

〔2013-12-06修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)