脑出血患者外周血干扰素－γ、细胞免疫球蛋白黏蛋白分子－3 mRNA表达及意义

脑出血患者外周血干扰素-γ、细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3 mRNA表达及意义

毕胜刘群1范佳2李冬王李鸣赵岩岩关雪莲侯丽淳田嘉莹王增冕李晓涛李培育

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154002)

摘要〔〕目的探讨脑出血患者外周血干扰素(IFN)-γ、细胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3的表达及意义。方法96例脑出血患者均为发病6 h内来诊，按发病距采血时间分为≤6 h组、>6 h且≤24 h组、>24 h且≤72 h组和>72 h组。另选24例正常人为对照组。检测各组IFN-γ的水平及外周血中单个核细胞TIM-3 mRNA的表达。结果各实验组IFN-γ的表达与对照组均具有统计学差异(P<0.05)。>24 h且≤72 h组IFN-γ的表达显著高于其他实验组(P<0.05)。各实验组TIM-3 mRNA的表达与对照组均具有统计学差异(P<0.05)。>24 h且≤72 h组TIM-3 mRNA的表达显著高于其他实验组(P<0.05)。结论脑出血患者发病6 h内，IFN-γ、TIM-3的表达增加，IFN-γ和TIM-3 参与脑出血后的病理过程。

关键词〔〕脑出血;干扰素(IFN)-γ；细胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3

中图分类号〔〕R743.34〔

基金项目：黑龙江省自然科学

通讯作者：李培育(1980-)，男，主治医师，硕士，主要从事脑血管病的发病机制研究。

1吉林大学白求恩第一医院2吉林大学白求恩第二医院

第一作者：毕胜(1981-)，女，主治医师，博士，主要从事脑血管病的发病机制研究。

脑出血约占全部脑血管疾病发病的30%，在我国表现为北方发病率高于南方的趋势。已有研究〔1〕发现T细胞及其分泌的细胞因子亦参与脑出血后的炎症反应。CD4+T 细胞按照分化和功能特征分成Th1细胞，Tp细胞，Treg细胞、Th17细胞。干扰素(IFN)-γ 是Th1细胞的特征性细胞因子，广泛参与Th1细胞的多种活动。细胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3是表达于Th1细胞、Th17细胞等多种细胞表面的分子。TIM-3 mRNA与缺血再灌注损伤等多种机制相关〔2,3〕。本研究通过检测IFN-γ、TIM-3mRNA的表达，探究其在脑出血发病中的意义。

1材料与方法

1.1主要试剂人IFN-γ ELISA 检测试剂盒，美国R&D公司；RT-PCR试剂盒，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；PCR引物，上海生工生物工程有限公司；Trizol试剂，大连宝生物工程有限公司。

1.2实验分组2013年1月至2014年12月我院神经内科收治的脑出血患者96例，均符合诊断标准〔4〕，均为发病6 h内来诊。按发病距采血时间分为4组，分别为≤6 h组、>6 h且≤24 h组、>24 h且≤72 h组和>72 h组，每组24例。另选取体检中心24例正常人作为对照组。所有病例均脑血管疾病家族史，无肝肾疾病、血液系统疾病、内分泌系统疾病、自身免疫病、感染性疾病。

1.3取材抽取肘静脉血2 ml，置于抗凝管中，采血1 h内用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)；另取2 ml装于试管内，静置30 min，以2 000 r/min离心15 min分离血清，分装-80℃冰箱冻存。对照组取材方法同前。

1.4IFN-γ和TIM-3 mRNA检测ELISA 法检测IFN-γ 的水平。RT-PCR 法检测TIM-3 mRNA 水平。内参基因 β-actin(299 bp)的引物序列为：上游 5'-CCTGGACTTCGAGCAAGA-3'，下游 5'-GGGCAGTGATCTCCTTCT-3'；目的基因 TIM-3(558 bp)的引物序列为：上游 5'-CCAAAT CCCAGGCATAAT-3'，下游 5'-AAGCGACAACCCAAAGGT-3'；PCR 的反应条件为：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，反应最后是72℃延伸5 min，总共30个循环。反应结束后，将PCR产物跑1.5%琼脂糖凝胶电泳(120 V，20 min)，凝胶成像系统分析数据。

1.5统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1各组血清IFN-γ水平的比较各实验组血清中 IFN-γ水平与对照组相比显著增加(P<0.05)。>24 h且≤72 h组血清中IFN-γ的水平显著高于其他各实验组(P<0.05)。见表1。

2.2各组 PBMC 中 TIM-3 mRNA 的表达各实验组PBMC中TIM-3 mRNA的表达与对照组相比显著增加(P<0.05)。>24 h且≤72 h 组PBMC中TIM-3 mRNA的表达显著高于其他各实验组(P<0.05)。见表1。

表1　各组血清IFN-γ水平和PBMC中TIM-3 mRNA表达

与对照组比较：1)P<0.05；与≤6 h组比较：2)P<0.05；与>6 h且≤24 h组比较：3)P<0.05；与>24 h且≤72 h组比较：4)P<0.05

3讨论

脑出血后机体发生一系列复杂的病理生理过程，研究证实炎症反应在脑出血发病中发挥重要作用。本实验提示IFN-γ、TIM-3 参与脑出血后的病理过程。IFN-γ主要是由Th1细胞分泌的细胞因子，主要参与细胞免疫。在对自身免疫性脑脊髓膜炎等多种炎症性疾病的研究中发现，IFN-γ参与其发病的病理过程，并且能够加剧中枢神经系统的组织损伤〔5,6〕。本实验提示脑出血早期，Th1细胞被动员活化，分泌IFN-γ，参与炎症反应等病理过程。

TIMs家族是一类重要的跨膜糖蛋白，TIM-3是其中重要的一种成员，表达于Th1、Th17细胞等多种细胞表面，在适应性免疫及天然免疫中均发挥重要作用。TIM-3与其配体半乳凝素-9结合，能负性调节Th1细胞，减弱Th1应答，诱导Th1细胞凋亡。半乳凝素-9在体内能抑制幼稚的T细胞向Th17细胞分化。研究人员在对脑缺血再灌注损伤的研究中发现，TIM-3 参与脑的缺血再损伤，患者外周血中IL-17的水平与其CD4+T细胞表达的TIM-3具有明确的相关性〔2〕。本实验提示脑出血早期，TIM-3参与脑出血早期的病理过程。已有研究证实，脑出血早期外周血中IL-17表达增加〔7〕，提示TIM-3可能通过多种调控机制，参与脑出血后多种细胞因子的表达，共同参与脑出血后的炎症反应，其具体机制有待于进一步研究。

4参考文献

1林杰，张军，张国华.脑出血血肿周围组织损伤的炎症反应机制〔J〕.国外医学·脑血管疾病分册，2004；12(7)：517-9.

2Zhao D,Hou N,Cui M,etal. Increased T cell immunoglobulin and mucin domain 3 positively correlate with systemic IL-17 and TNF-α level in the acute phase of ischemic stroke 〔J〕. J Clin Immunol, 2011；31(4):719-27.

3Li HL, Kostulas N, Huang YM,etal. IL-17 and IFN-γ mRNA expression is increased in the brain and systemically after permanent middle cerebral artery occlusion in the rat 〔J〕. J Neuroimmunol, 2001；116(1): 5-14.

4王新德.各类脑血管疾病诊断要点 〔J〕.中华神经科杂志,1996；29(6):379.

5Lambertsen KL, Gregersen R, Meldgaard M,etal. A role for interferon-gamma in focal cerebral ischemia in mice 〔J〕. J Neuropathol Exp Neurol,2004；63(9):942-55.

6Kim IJ, Beck HN, Lein PJ,etal. Interferon gamma induces ret rograde dendritic retraction and inhibits synapse formation 〔J〕. J Neurosci, 2002；22(11):4530-9.

7毕胜,范佳,陈光, 等.脑出血患者外周血IL-17，IL-23的表达及意义 〔J〕. 中国老年学杂志,2014；34(15):4135-6.

〔2014-12-19修回〕

(编辑苑云杰)