CyclinB2、CDK1在胃癌中的表达水平及生物学意义

CyclinB2、CDK1在胃癌中的表达水平及生物学意义

王晓明梁国栋杨玉波王斌刘海瑞王淑红

(吉林省肿瘤医院腹部肿瘤外一科,吉林长春130012)

摘要〔〕目的探讨胃癌患者瘤组织中细胞周期蛋白(Cyclin)B2、细胞周期依赖性激酶(CDK1)的表达水平及其预后的临床生物学意义。方法共收集60例胃癌患者组织标本，采用免疫组化法检测胃癌及癌旁组织CyclinB2、CDK1表达水平进而分析其与患者临床病理特征及长期预后的相关性。结果胃癌组织CyclinB2、CDK1表达水平明显高于癌旁组织(χ2=17.515,P<0.001)，病理为Ⅲ期患者的瘤组织中CyclinB2、CDK1的表达水平明显高于术后病理Ⅰ期，临床统计学证实CyclinB2、CDK1的表达水平与TNM分期有关(χ2=11.545,P=0.05)。CyclinB2、CDK1高表达的胃癌患者总生存率明显差于CyclinB2、CDK1低表达者(P=0.039)，而无疾病生存率两者无显著性差异(P=0.096)。 结论胃癌患者CyclinB2、CDK1高表达可能提示肿瘤侵袭的生物学能力较强，并与患者低总生存率(OS)有关。

关键词〔〕胃癌；细胞周期蛋白B2；细胞周期依赖性激酶

中图分类号〔〕R735.1〔

基金项目：吉林省科技厅资助项目(200705274)

通讯作者：梁国栋(1983-)，男，主治医师，博士，主要从事普通外科的临床研究。

第一作者：王晓明(1962-)，男,副主任医师，主要从事消化道肿瘤外科临床研究。

细胞周期蛋白(Cyclin)和细胞周期依赖性激酶(CDK)是细胞周期调控的重要分子，在细胞有丝分裂周期的不同时段发挥重要的生物学作用，使细胞周期正常有序的运行。研究表明在其他消化道肿瘤中均存在Cyclin、CDK的过表达，与其侵袭、转移、增殖、分化等生物学行为密切相关，目前胃癌联合检测CyclinB2、CDK1文献报道较少。本实验通过免疫组化、荧光原位杂交(FISH)等方法研究CyclinB2和CDK1在胃癌组织(不同TNM分期)、癌旁组织、正常胃组织中的表达，及其生物学行为与患者预后的相关性〔1〕。近期国外有研究提示CyclinB2为进展期胃癌预后不良标志之一〔2〕。国内虽有类似研究，但大多缺乏长期预后数据〔3〕。本研究旨在探究CyclinB2、 CDK1在国人胃癌患者中表达水平及其预后意义。

1材料与方法

1.1研究对象2013年6月至2014年6月收集我住院手术切除胃癌组织的患者60例，年龄37～72岁。45例患者行远端胃癌切除术，15例患者行全胃切除术。肿瘤<5 cm 26例，>5 cm 34例；低分化30例，中/高度分化30例；临床分期ⅡA期6例，ⅡB期11例，ⅢA期12例，ⅢB期14例，ⅢC期17例；T分期：T2期9例，T3期26例，T4期25例；N分期N0期7例，N1期15例，N2期19例，N3期19例。纳入标准：所有患者均为初始治疗，未行术前新辅助化疗、无服用生物免疫制剂历史。术后病理证实为胃腺癌患者60例，其中男30例，女30例。均行D2+淋巴结清扫术(开腹手术51例，腹腔镜手术9例)。两位临床高年资病理医生(副教授)依据国际抗癌联盟(AJCC)胃癌临床病理分型对病人进行术后TNM分期〔4〕。手术后将病人新鲜癌胃组织(原发灶)与癌旁组织进行免疫组化及FISH病理分析，癌旁组织选择距癌灶>5 cm的胃组织，本实验得到吉林省肿瘤医院伦理委员会批准并且征得患者本人的同意。

1.2免疫组化样本经4%多聚甲醛固定后，包埋于石蜡中。将组织切割为4.0 μm厚的连续切片。二甲苯脱蜡30 min后，梯度乙醇水化。切片浸于枸橼酸缓冲溶液中进行复性，再用3%的H2O2抑制内源性过氧化酶。切片置于10%皂素中修复，余步骤按卵蛋白-生物素-酶复合物染色(ABC)法进行，常规行苏木精-伊红染色，免疫组化染色，鼠单克隆抗体CyclinB2和CDK1均购于上海BOSTER生物有限公司，ABC购于(英国Leica Biosystems Newcastle公司)。

结果判断标准： 用Olympus显微镜观察DAB-染色切片，染色强度分级由吉林省肿瘤医院病理科负责，事前未告知临床诊断分期。胞质、胞核出现棕黄色，黄褐色颗粒为阳性染色细胞，光镜下每张切片随机选取高倍视野(400倍)计数500个细胞，根据染色阳性细胞数进行评分〔2〕： 0分为无色，1分为5%～25%细胞表达CyclinB2和CDK1，2分为25%～50%，3分50%～75%，4分75%～100%。根据染色评分结果，将患者分为CyclinB2和CDK1低表达(评分为0～1分)与CyclinB2和CDK1高表达(评分为2～4分)。

1.3术后辅助化疗患者术后行替吉奥(爱斯万日本大鹏株式会社)联合奥沙利铂(乐沙定法国赛诺菲)辅助化疗，根据患者耐受情况及病情变化等决定化疗疗程，最大疗程数为6个疗程。化疗方案：替吉奥(爱斯万日本大鹏株式会社)40 mg/m2口服，2次/d，第1～14天；奥沙利铂(乐沙定法国赛诺菲)130 mg/m2避光4 h泵入，第1天，每3 w为1个周期。

1.4统计学分析采用SPSS16.0软件，计数资料比较采用Pearsonχ2检验或趋势χ2分析及秩和检验。两小样本计量资料比较采用t检验。采用Kaplan-Meier法进行生存分析，组间比较采用log秩和检验。

2结果

2.1胃癌与癌旁组织CyclinB2和CDK1表达水平60例胃癌患者中29例呈现CyclinB2和CDK1高表达，其中2分为14例，3分为15例。癌旁组织6例为CyclinB2和CDK1高表达，均为2分，两者比较有统计学差异(χ2=17.515,P<0.001)。

2.2CyclinB2和CDK1表达水平与胃癌临床病理因素的相关性研究CyclinB2和CDK1高表达与患者性别、肿瘤大小无关(均P>0.05)，但与患者TNM分期相关，CyclinB2和CDK1高表达患者TNM分期明显高于低表达者(均P<0.05)。趋势χ2分析表明，CyclinB2和CDK1表达水平与TNM分期有关，分期越高，CyclinB2和CDK1高表达患者所占比例越高(P=0.05)。CyclinB2和CDK1表达水平与患者临床分期、淋巴结转移情况均存在相关性(均P>0.05)。见表1。

表1　CyclinB2和CDK1表达水平与

2.3长期预后患者随访6～24个月，中位随访24个月，失访4例，失访率8.16%。CyclinB2和CDK1高表达胃癌患者总生存率明显差于CyclinB2和CDK1低表达者(P=0.039)，无疾病生存率无显著差异(P=0.096)。见图1，图2。

图1　CyclinB2和CDK1表达水平与 患者总生存率的相关性

图2　CyclinB2和CDK1表达水平与 患者无疾病生存率的相关性

3讨论

肿瘤基本生物学行为的特征是细胞的增殖(有丝分裂)和分化失控，多数由于癌基因的激活和抑癌基因的失活，干扰了细胞正常有序的增殖分化，而最终归结至细胞周期调节机制的异常。细胞周期主要由Cyclin和CDK及CK1共同完成。细胞周期G2末期是重要的检查点，决定着G2/M的转换，学者Yang等发现CyclinB1、2在胃癌G1细胞中及瘤细胞株中非时相性过度表达，可使细胞周期关键点G2/M转变时间缩短，加速细胞周期的转换，使细胞过度增殖最终导致癌变，在食管癌、大肠癌的研究中也发现这两种蛋白的异常表达。由此可以推论CyclinB2和CDK1在细胞周期的调控和肿瘤细胞的形成中起到了重要的作用，且可能为消化道肿瘤发生过程中的一个较早的分子事件。通过实验研究发现，不同分化程度的肿瘤CyclinB2和CDK1表达差别无显著性意义，这可能与本实验选取的例数较少有关，在食道癌及喉癌中的表达情况恰恰相反，说明也存在着器官的差异性。CyclinB2和CDK1在人类多种肿瘤细胞表面过表达，并与细胞运动性及肿瘤细胞转移密切相关〔5〕。临床研究表明，高表达CyclinB2和CDK1的乳腺癌、肾癌、肝癌及胆管癌等恶性肿瘤患者，其预后不良。然而CyclinB2和CDK1在胃癌中的预后意义研究较少〔2,6〕。Li等〔7〕研究结果支持本研究结论。而Kang等〔2〕研究中CyclinB2和CDK1表达水平与肿瘤T分期的相关性并无统计学差异，但CyclinB2和CDK1表达水平似乎随着肿瘤T分期升高而增加。以上研究结果提示CyclinB2和CDK1高表达可能是肿瘤侵袭能力增强的表现。

本研究患者术后采用统一辅助化疗方案，随访失访率<10%，提示数据质量较好。结果与国内外研究〔2〕一致。但本研究并未发现CyclinB2和CDK1高表达与患者无复发生存率有关。可能与本研究样本量少、随访时间短有关，也可能与人群基因遗传背景不同有关，尚待扩大样本进一步研究。

4参考文献

1Sadej R,Grudowska A,Turczyk L,etal.CD151 in cancer progression and metastasis:a complex scenario〔J〕.Lab Invest,2014;94(1):41-51.

2Kang BW,Lee D,Chung HY,etal.Tetraspanin CD151 expression associated with prognosis for patients with advanced gastric cancer〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol,2013;139(11):1835-43.

3马晓丽,黄淑红,黄敬爱,等.CyclinB1、CDK1在胃癌中的表达及其意义〔J〕.中国现代普通外科进展,2004;7(5):272-4.

4Duman-Scheel M,Weng L,Xin S,etal.Hedgehog regulates cell growth and proliferation by inducting Cyclin D and Cyclin E〔J〕.Nature,2002;417(6886):299-304.

5Romanska HM,Berditchevski F.Tetraspanins in human epithelial malignancies〔J〕.J Pathol,2011;223(1):4-14.

6李桃,齐洁敏.整合素α5β1、CD151在胃癌中的表达及意义〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(11):2527-9.

7Li XK,Motwani M,Tong W,etal.Huanglin,a chinese herbal extract,inhibits cell growth by suppressing the expression of cyclin B1 and inhibiting CDC2 kinase activity in human cancer cells〔J〕.Mol Pharmacol,2000;58(6):1287-93.

〔2014-08-12修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)