辛伐他汀对慢性阻塞性肺病大鼠血浆及肺泡灌洗液中5－羟色胺表达的影响

辛伐他汀对慢性阻塞性肺病大鼠血浆及肺泡灌洗液中5-羟色胺表达的影响

王雅杰姜雪张立海王丽红袁林栋孙武装

(河北医科大学第一医院呼吸内科，河北石家庄050031)

摘要〔〕目的观察5-羟色胺(HT)在吸烟诱导的慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠血浆及肺泡灌洗液中的表达，探讨5-HT在COPD发病中的作用及辛伐他汀对其影响。方法①采用烟熏法建立COPD大鼠模型。将30只大鼠随机分为三组：对照组、烟雾暴露组、辛伐他汀组各10只。自烟雾暴露之日起辛伐他汀组给予辛伐他汀(5 mg/kg)，于烟雾暴露前灌胃，每日一次。16 w后，测量体重、肺动脉压(PAP)、肺功能，并对肺组织病理形态学进行观察。②采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测5-HT在COPD大鼠血浆及肺泡灌洗液中的含量，观察辛伐他汀对其表达的影响。结果①三组实验前体重无明显差异(P>0.05)。实验结束时，烟雾暴露组体重较对照组明显下降(P<0.01)；辛伐他汀组体重较烟雾暴露组升高(P<0.05)。②与对照组比较，烟雾暴露组平均内衬间隔(MLI)明显增加(P<0.01)，平均肺泡数(MAN)明显降低(P<0.01)；辛伐他汀治疗后 MLI降低(P<0.05)，MAN增加(P<0.01)。③相对于对照组，烟雾暴露组动态肺顺应性(Cdy)、用力呼气容积(FEV)0.3/用力呼气量(FVC)明显下降(P<0.05)，呼气相气道相应阻力(Re)、吸气相气道相应阻力(Ri)升高(P<0.05)；辛伐他汀组治疗后Re、Ri、FEV0.3/FVC、Cdy相对于烟雾暴露组均有改善(P<0.05)。与对照组比较，烟雾暴露组和辛伐他汀组mPAP明显升高(P<0.05)。辛伐他汀治疗后mPAP明显降低(P<0.05)。④三组右心和左心室、室间隔重量比〔RV/(LV+S)〕值差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，烟雾暴露组RV/(LV+S)增大(P<0.05)；辛伐他汀组治疗后RV/(LV+S)降低(P<0.05)。⑤与对照组比较，烟雾暴露组及辛伐他汀组血浆及肺组织中5-HT较对照组明显升高(P<0.05)。肺泡灌洗液中5-HT水平无明显变化(P>0.05)。辛伐他汀组治疗后血浆及肺组织中5-HT降低(P<0.05)，肺泡灌洗液中5-HT水平无明显变化(P>0.05)。⑥5-HT 在血浆中及肺组织中的表达与右心室肥厚指数(RVHI)呈正相关(r=0.702，0.543，P=0.000，0.002)，与mPAP呈正相关(r=0.772，0.821，P=0.000)。结论①大鼠香烟烟雾暴露16 w建立COPD模型成功。②5-HT在COPD发生、发展过程中有明显的变化及联系，在COPD发生发展中起重要作用。辛伐他汀可能是治疗COPD有效的方法之一。

关键词〔〕慢性阻塞性肺病；吸烟；5-HT；辛伐他汀

中图分类号〔〕R563.3〔

通讯作者：孙武装(1966-)，男，主任医师，博士，主要从事呼吸系统疾病研究。

第一作者：王雅杰(1980-)，女，主治医师，主要从事慢性阻塞性肺病研究。

世界银行/世界卫生组织的资料表明，至2020年慢性阻塞性肺疾病(COPD)将位居世界疾病经济负担的第五位，到2020年COPD将位居全球死亡原因的第三位〔1〕。目前一致认为其主要病理改变为气道、肺实质和肺血管的慢性炎症，发展到晚期可出现肺动脉高压(PAH)、肺源性心脏病等并发症。研究发现5-羟色胺(HT)与呼吸系统疾病有密切关系(如阻塞性睡眠呼吸暂停〔2〕、支气管哮喘〔3〕、PAH〔4〕等)。血液中5-HT主要储存于血小板中，当受到炎症反应、低氧等因素刺激时，血小板大量释放5-HT，从而引起一系列的病理生理反应。有学者认为，5-HT与肺血管平滑肌上多种受体结合可引起肺血管收缩〔6〕及肺血管平滑肌细胞(PASMC)增殖〔7〕。他汀类药物即三羟基三甲基戊二酰辅酶A(HMG-CA)。还原酶抑制剂通过降低血脂，减少降低心血管事件发生的防治效果，已经得到证实。近年来，人们越来越关注他汀类药物的非降脂作用：主要包括抑制平滑肌细胞的增殖、黏附和迁移，改善血管内皮功能，抗炎抗氧化，免疫调节，抗血栓形成，稳定动脉硬化粥样斑块及可能的抗心律失常，抗肿瘤，抗骨质疏松等。本研究拟揭示在COPD病理状态下5-HT水平变化及辛伐他汀对其的影响。

1材料与方法

1.1动物分组与模型建立采用宋一平等〔8〕烟熏方法制作大鼠COPD PAH模型，雄性健康SD大鼠30只，体重(100±10)g，6周龄，河北医科大学实验动物中心提供，平均随机分为3组：对照组、烟雾暴露组、辛伐他汀组各10只。各组平均体重差异无统计学意义。采用被动烟熏法建立COPD PAH大鼠模型：烟雾暴露组及辛伐他汀组每日在熏烟箱内给予烟雾干预，每次吸烟20支(钻石牌香烟)，每次吸烟1 h，2次/d，日间两次吸烟间隔4～5 h，共16 w，并同时给予辛伐他汀组(5 mg/kg)灌胃干预，1次/d。

1.2肺功能测定饲养16 w后，测量大鼠体重，用1%苯巴比妥(50 mg/kg)经腹腔内注射麻醉，切开气管、插入气管插管(为一静脉针去针头的塑料软管)，将大鼠放入动物肺功能仪中(北京兰博科技有限公司)，接压力传感器，设置基本吸呼比及气道压力，进行肺功能测试。监测大鼠8个自主呼吸周期，记录肺气道压力，肺容积的变化，计算出呼气相气道相应阻力(Re)、吸气相气道相应阻力(Ri)。通过三通管向肺内输注6 ml空气使大鼠被动深呼吸，随即测定用力呼气量(FVC)和用力呼气容积(FEV)0.3，并计算FEV0.3/FVC。

1.3支气管肺泡灌洗液(BALF)及外周血、肺标本的采集解剖暴露心肺，将3 ml生理盐水经气管插管缓慢注入左肺，停留20 s后再回抽，反复3次(回收率70%～80%)，将BALF注入无菌离心管内，混匀。剪取右肺前三个肺叶，放入液氮中储存；剪取右肺剩余的一个肺叶放入装有甲醛的广口瓶中(待以后病理形态学检查用)。

1.4HE染色中性甲醛固定后脱水、石蜡包埋常规病理学切片HE染色，电镜下观察肺组织病理形态学变化，应用日本Olympus显微镜，BHEC显微镜彩色图像处理系统观察肺组织病理形态并测量：①平均内衬间隔(MLI)：在显微镜视野中央划一十字交叉线，计算交叉线相交的所有肺泡隔数(NS)，然后计算十字线总长度(L)，MLI=L/NS。该指标反映肺泡平均内径的大小。②平均肺泡数(MAN)：精确计数每个视野中的肺泡数(Na)，并计算出每个视野的面积(S)，MAN=Na/S，算出每个视野的每mm2平均肺泡数，该指标反映肺泡密度大小。

1.55-HT的测定采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测5-HT的含量，具体按照厂家说明书进行。第一单抗为美国Abnova公司，5-HT检测灵敏度为5 ng/ml，检测批内误差均<10%，批间误差<15%。酶标仪产自美国BIO-TEK型号：ELx800。

1.6测量平均肺动脉压(mPAP)和左右心室比值参照孙波等〔9〕的方法。所有大鼠分离右颈外静脉，经右颈外静脉行右心插管，进行 mPAP 测定，导管另一端经压力换能器与多道生理记录仪(四川成都仪器厂)连接并记录mPAP。处死大鼠后，完整取出心脏，滤纸吸水后分别称重，测右室(RV)游离壁及左室和室间隔(LV+S)的质量，计算右心和左心室、室间隔重量比(RVHI)=RV/(LV+S)比值，以此作为判断大鼠右室肥大的指标，并以此作为间接反映肺动脉压力的指标。

1.7统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，t检验，Logistic回归分析。

2结果

2.1大鼠体重实验前3组体重无显著差异(P>0.05)。实验结束后，烟雾暴露组及辛伐他汀组体重较对照组明显下降(P<0.01)；辛伐他汀组治疗后体重较烟雾暴露组明显增加(P<0.05)。见表1。

2.2大鼠肺组织病理学变化对照组大体肺组织标本光滑、红润、平整、有弹性。显微镜下观察气管壁及肺泡清晰，无炎性细胞浸润。气道上皮的纤毛规整，肺泡间隔正常，未见肺大疱。与对照组比较，烟雾暴露组大体肺组织标本体积增大，外表粗糙，颜色苍白，弹性差。镜下观察气管壁较对照组增厚、管腔变窄，气道上皮的纤毛排列紊乱、局部纤毛脱落。小血管及细支气管壁周围均有大量炎性细胞浸润；肺泡壁变薄，形成肺大疱。辛伐他汀组肺脏较烟雾暴露组肺组织稍有缩小。肺泡壁稍变薄，肺泡腔略减小，仍有肺气肿改变，但较烟雾暴露组局限，气管壁及小血管周围炎性细胞浸润减少，主要以局限性肺气肿样改变为主，纤毛排列紊乱及脱落现象较烟雾暴露组减轻。见图1。与对照组比较，烟雾暴露组MLI 明显增加(P<0.01)，MAN明显降低(P<0.01)；与烟雾暴露组比较，辛伐他汀组 MLI降低(P<0.05)，MAN增加(P<0.01)。见表2。

表1　烟雾暴露前后3组体重的变化

与对照组比较：1)P<0.01；与烟雾暴露组比较：2)P<0.05；表2、4同

图1　各组肺组织病理HE染色(×400)

分组MLI(μm)MAN(个/mm2)对照组41.274±2.737381.051±35.756烟雾暴露组97.803±6.9941)170.606±29.5991)辛伐他汀组90.701±6.8411)2)201.373±30.4331)2)F/P值275.617/0.000125.810/0.000

2.3mPAP和RVHI与对照组比较，烟雾暴露组和辛伐他汀组mPAP明显升高(P<0.01)。与烟雾暴露组比较，辛伐他汀组mPAP明显降低(P<0.01)。与对照组比较，烟雾暴露组RVHI显著增大(P<0.01)；与烟雾暴露组比较，辛伐他汀组RVHI显著降低(P<0.01)。见表3。

表3　3组mPAP、RVHI比较 ± s， n=10)

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与烟雾暴露组比较：3)P<0.01

2.4肺功能与对照组比较，烟雾暴露组动态肺顺应性(Cdy)、FEV0.3/FVC显著下降(均P<0.01)，Re、Ri显著升高(均P<0.01)；而与烟雾暴露组比较，辛伐他汀组Re、FEV0.3/FVC、Cdy均有改善(均P<0.05)，Re、Ri有所下降(均P<0.05)。见表4。

表4　3组肺功能比较

2.55-HT的测定结果与对照组比较，烟雾暴露组及辛伐他汀组血浆及肺组织中5-HT明显升高(P<0.01)。BALF 5-HT水平无明显变化(P>0.05)。与烟雾暴露组比较，辛伐他汀组血浆及肺组织中5-HT明显降低(P<0.01)，BALF 5-HT水平无明显变化(P>0.05)。见表5。

2.6相关性分析5-HT 在血浆中及肺组织中的表达与RVHI呈正相关(r=0.702，0.543；P=0.000，0.002)，与mPAP呈正相关(r=0.772，0.821；P均=0.000)。

表5　3组血浆及肺组织中5-HT的表达

与对照组比较：1)P<0.01；与烟雾暴露组比较：2)P<0.01

3讨论

COPD的发生、发展与肺脏对有害气体或颗粒的异常炎症有关〔10〕，而导致COPD发生的最重要危险性因素是烟草〔11，12〕。香烟烟雾中尼古丁、氧自由基、焦油等有害物质对肺脏产生的局部炎症反应及大量的氧自由基对肺部产生氧化应激反应，两者相互影响、相互促进，在COPD发病中共同发挥着重要作用。激活的炎症细胞释放多种炎症细胞因子，如白三烯、肿瘤坏死因子(TNF)-α白细胞介素(IL)等，引起气道及肺实质反复损伤，从而导致肺泡壁、气道壁的结构破坏和重塑〔13〕。随着病程发展，损伤和修复过程循环发生，逐渐出现肺血管重构、PAH产生及肺心病形成。

辛伐他汀通过竞争性抑制HMG-CoA还原酶，阻断胆固醇生成，对心血管保护作用超出单纯降脂作用，这与其抗增殖、抗炎性作用和改善内皮细胞功能密切相关〔14～18〕。Lee等〔19〕采用烟熏(10支/d，连续16 w)诱导的大鼠肺气肿、PAH模型，辛伐他汀干预组(5 mg·kg-1·d-1)明显抑制烟熏诱导的肺动脉压力增高，减轻烟熏引起的肺小动脉肌型化，对肺血管周围炎症细胞浸润有明显抑制作用。近年数项研究报道他汀类药物可改善PAH大鼠肺血流动力学和肺血管重构改变〔20～25〕。本研究验证了上述理论。

5-HT是体内一个重要的丝裂素，它能促进肺血管平滑肌增生，肺动脉血管收缩和局部微血栓形成〔26〕。本文说明在COPD PAH大鼠模型中，5-HT高表达与肺动脉压力升高是相关的。他汀类药物对COPD PAH大鼠具有治疗作用。COPD PAH大鼠模型中，5-HT能够促进右心室肥厚。他汀类药物对右心室几何构型的改变也有一定的保护作用。野百合碱注射的大鼠模型中，他汀类药物能明显改善大鼠血流动力学参数及抑制5-HT的表达，推测他汀类药物对野百合碱诱导的大鼠PAH的治疗作用与其抑制5-HT的表达可能有关〔27，28〕，此结论与本研究结果有相似之处。

综上，COPD大鼠肺组织及血浆中5-HT高表达促进肺血管重构，而辛伐他汀通过缓解肺血管重构来降低肺动脉压力，而辛伐他汀是否能用于临床，还需要基础实验研究。

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〔2013-12-17修回〕

(编辑苑云杰)