老年SD大鼠脾脏和外周血T淋巴细胞亚群的变化

老年SD大鼠脾脏和外周血T淋巴细胞亚群的变化

张江兰李芸吉灵改任君旭张耕吴靖芳

(河北北方学院，河北张家口075000)

摘要〔〕目的探讨 SD老年大鼠脾脏和外周血T淋巴细胞亚群的变化。方法流式细胞仪检测老年大鼠(10只)和青年鼠(5只)脾脏和血液T淋巴细胞亚群的变化。结果SD老年大鼠脾脏和外周血T淋巴细胞亚群阳性率的变化相一致，CD3+、CD4+、CD8+细胞阳性率均低于青年组水平，且CD4细胞阳性率均明显低于青年组(P<0.05)；CD4+/CD8+比值均低于青年组，在脾脏CD4+/CD8+比值与青年组相比具有显著性差异(P<0.05)。结论SD老年大鼠脾脏和外周血T胞亚群阳性率均减少，且CD4+/CD8+比值明显降低，提示SD老年大鼠免疫功能的衰退和紊乱与T细胞密切相关。

关键词〔〕脾脏；外周血；淋巴细胞；流式细胞技术

中图分类号〔〕R57〔

基金项目：张家口市科技攻关计划(12110065G-1)；河北北方学院自然科学研究计划项目(No.2001022)

第一作者：张江兰(1981-),女,讲师,主要从事胃溃疡病及其神经免疫调节研究。

在免疫系统中，各淋巴细胞亚群之间相互作用，维持着机体的正常免疫功能，随着年龄的增长，各淋巴细胞亚群的数量和功能均会发生不同程度的改变。美国病理学家Wolford首次提出老化的免疫学假设，认为免疫系统是调节老化过程的主要系统之一，其从根本上参与了机体老化的整个过程〔1〕。本实验通过免疫荧光标记流式细胞技术检测SD老年大鼠脾脏和外周血淋巴细胞各亚群的变化。

1材料与方法

1.1材料20月龄SD老年大鼠共10只，6月龄SD青年鼠5只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。然后在本组长期饲养，体重280～300 g。小鼠抗大鼠单克隆抗体：CD3-PE、CD4-FITC、CD8-FITC和10×细胞裂解液(FACS Lysing Solution)，均购自美国BD/Pharmingen 公司。流式细胞仪(FACS Aria)购自美国BD公司。

1.2取材用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉。动物被麻醉后，迅速开胸，心脏穿刺取血，放置于肝素抗凝管中，行流式细胞仪检测；迅速开腹，采取脾组条，立即进行FACS检测。

1.3脾脏组织淋巴细胞亚群检测采集大鼠脾脏组织，放入200目不锈钢筛网，使用注射器针心研磨；收集细胞，沉降5 min，转入另一肝素抗凝试管中，1 500 r/min，离心10 min，弃上清；加入红细胞裂解液2 ml充分混匀，避光放置10 min，4℃ 1 500 r/min，5 min离心去上清，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液(pH7.4)洗涤；用细胞计数板进行计数1×106/ml，取300 μl细胞悬液，平均加入到2个上样管中，每管分别加入CD3-PE/CD4-FITC和CD3-PE/CD8-FITC，同时设立空白对照组(不加任何抗体)，4℃避光反应30 min，4℃ 1 500 r/min，5 min离心去上清；0.01 mol/LPBS缓冲液(pH7.4)洗涤；加200 μl PBS重悬细胞，逐个安放在流式细胞仪上进行检测。数据用Cellquest3.1进行荧光参数的获取和分析。在进行流式分析时，首先射门于淋巴细胞，然后射门于CD4+和CD8+细胞，分析各淋巴细胞亚群的阳性率。

1.4外周血淋巴细胞亚群的检测每只动物取抗凝血300 μl平均加入到2个上样管中，每管分别加入CD3-PE/CD4-FITC和CD3-PE/CD8-FITC，同时设立空白对照组(不加任何抗体)，4℃避光反应30 min；每管加入1×细胞裂解液2 ml充分混匀，避光放置10 min，4℃ 1 500 r/min，5 min离心去上清，0.01 mol/L PBS缓冲液(pH7.4)洗涤2次；加200 μl PBS重悬细胞，逐个安放在FACS上进行检测。

1.5统计学处理用SPSS13.0 统计软件行ANOVA方差分析及q检验。

2结果

SD老年大鼠脾脏和外周血各淋巴细胞亚群阳性率的变化一致，CD3+、CD4+、CD8细胞阳性率均低于青年组水平；其中CD4+细胞阳性率均明显低于青年组(P<0.05)；脾脏和外周血CD4+/CD8+比值均低于青年组，两组脾脏CD4+/CD8+比值差异显著(P<0.05)。见表1。

表1　老年SD大鼠脾脏和外周血T淋巴细胞亚群的

与青年组比较：1)P<0.05

3讨论

淋巴细胞各亚群数量的减少和功能的改变是老年人免疫功能衰退的重要因素。本研究发现老年SD大鼠脾脏和外周血总T淋巴细胞(CD3+)，抑制性、杀伤T淋巴细胞(CD8+)，辅助性T淋巴细胞(CD4+)阳性率均较青年组低。老年人免疫器官的衰退, 最突出的表现是T、B细胞的功能减退, 对非特异性有丝分裂原PHA、ConA及外来抗原反应性降低, 导致免疫功能下降, 易发生感染。陈海英等〔2〕研究显示老年组的胸腺细胞大量萎缩或凋亡，从胸腺迁移到外周活化的T细胞减少，这被认为是老年脾脏和外周血T细胞数量减少的主要原因之一；同时，T细胞功能也随增龄而恶化，造成细胞对外界信号的反应性和胞内信号的传导异常〔3〕，且表达抗bcl-2抗凋亡蛋白水平增高〔4〕，使具有免疫能力的T细胞持续的存活，这不仅使机体免疫功能下降，还可能会对自身产生攻击, 使机体易患自身免疫病、病毒感染和肿瘤等多种疾病。

同时，CD4+和CD8+细胞是一对相互制约的细胞〔5，6〕,生理状态下其数目在周围组织中保持相对稳定,以维持机体正常的细胞免疫功能，且CD4+/CD8+值可反映机体的细胞免疫功能状态，其值增高或降低都将影响机体的免疫功能异常或紊乱〔7〕，导致临床上许多疾病的产生。本实验证实SD老年大鼠细胞免疫功能异常和紊乱，也是机体免疫功能下降的重要原因。

总之，机体免疫老化是一个非常复杂的过程，对其具体机制的研究具有重要的意义。本实验发现SD老年大鼠免疫系统功能的衰退与T淋巴细胞亚群数量的减少和功能降低密切相关，为机体免疫衰老机制的研究提供了实验依据。

4参考文献

1何维.在免疫老化中T细胞结构和功能的变化〔J〕.中国免疫学杂志,2001;17(1):57-60.

2陈海英,陈建明,郑建盛.胸腺细胞渐进性凋亡对大鼠脾脏淋巴细胞增殖功能的影响〔J〕.长治医学院学报,2009;23(2):95-8.

3赵岚,韩鹦赢,沈鹏,等.CD4+CD25+调节性T细胞与衰老关系的研究进展〔J〕.国际老年医学杂志,2010;31(4):157-61.

4王真,邓洪斌,李电东.衰老小鼠脾脏T淋巴细胞凋亡特征的变化〔J〕.中华老年医学志,2003;22(11)：669-72.

5李春红,董磊,李柏青,等.实验性矽肺大鼠外周血和脾T 淋巴细胞亚群的动态变化〔J〕.环境与职业医学,2007;24(5):494-7.

6潘志文,杨凡,万海英.不同认知功能老年人淋巴细胞亚群和超敏C反应蛋白分析〔J〕.同济大学学报(医学版),2007;28(6):96-9.

7许丽艳，张盈华，尹国武，等.子宫内膜癌患者T细胞亚群、红细胞免疫与Ag、NORs定量分析的临床意义〔J〕.第四军医大学学报，2001;22(4): 353-5.

〔2014-05-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

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