苏拉明对肿瘤上清液诱发的淋巴管内皮细胞管腔形成能力的影响

苏拉明对肿瘤上清液诱发的淋巴管内皮细胞管腔形成能力的影响

徐永良孙平张大伟冯克俭张伟1

(牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江牡丹江157011)

摘要〔〕目的检测苏拉明对肺癌Calu-1细胞上清液诱发的淋巴管内皮细胞管腔形成能力的影响。方法应用免疫荧光染色对淋巴管内皮细胞进行鉴定；应用Matrigel立体培养法检测淋巴管内皮细胞管腔形成能力。结果苏拉明对淋巴管内皮细胞的管腔形成能力无显著影响；肿瘤上清液能够增强淋巴管内皮细胞的管腔形成能力，呈剂量依赖性；而苏拉明能够抑制肿瘤上清液诱发的淋巴管内皮细胞的管腔形成，并呈剂量依赖性。结论肿瘤上清液能够促进淋巴管内皮细胞的管腔形成，而苏拉明能够抑制这种促进作用。

关键词〔〕苏拉明；淋巴管内皮细胞；肿瘤上清液；管腔形成能力

中图分类号〔〕R730.2〔

项目基金

通讯作者：张伟(1976-)，男，主治医师，硕士，主要从事肿瘤血管和淋巴管生成的分子机制与调控研究。

1牡丹江医学院附属红旗医院

第一作者：徐永良(1978-)，男，硕士，主要从事淋巴管形态学及其发生机制的研究。

Impact of the suramin on the ability of lymphatic endothelial cells' tube formation induced by tumor supernatant fluid

XU Yong-Liang, SUN Ping, ZHANG Da-Wei，etal.

Department of Anatomy, Mudanjiang Medical University, Mudanjiang 157011, Heilongjiang, China

Abstract【】ObjectiveTo study the impact of the suramin on the tube formation induced by lung cancer Calu-1 cell supernatant.MethodsCell immunofluorescence was applied to test the lymphatic endothelial cells. Matrigel was used to test the ability of lymphatic endothelial cells' tube formation.ResultsSuramin had little effect on lymphatic endothelial cells' proliferation and the ability of tube formation. Tumor supernatant fluid enhanced the ability of tube formation in a dose-dependent, while suramin inhabited this change caused by tumor supernatant fluid in a dose-dependent.ConclusionsTumor supernatant fluid could promote the tube formation of lymphatic endothelial cells, while suramin could inhabit the tube formation of the lymphatic endothelial cells caused by tumor supernatant fluid.

【Key words】Suramin; Lymphatic endothelial cells; Tumor supernatant fluid; Tube formation

淋巴管是人类癌症发生转移的重要途径。因此，在淋巴结内发现癌灶是几乎所有的貌似局限的癌症预后不良的重要指标。许多的动物模型研究证明，抑制肿瘤局部淋巴结转移与控制远隔器官转移密切相关，说明通过淋巴结转移至远隔器官是肿瘤转移的方式之一〔1〕。Pader等〔2〕的研究认为肿瘤自身的淋巴管对于淋巴转移的发生更为重要，肿瘤中央的淋巴管多是无功能的，而肿瘤边缘的淋巴管对于淋巴转移的发生起着重要作用。近10年来，有关肿瘤淋巴管生成的大量实验研究和临床研究表明，针对肿瘤淋巴管生成进行靶向治疗有可能成为最有效地抑制肿瘤转移的治疗策略。本研究采用了肺癌Calu-1细胞系的上清液诱导淋巴管内皮细胞(LEC)的方法，加入苏拉明，以此来检测其对肿瘤淋巴管内皮细胞管腔形成能力的影响。

1材料与方法

1.1淋巴管内皮细胞的分离、培养及鉴定实验方法及鉴定结果参照文献〔3〕。

1.2细胞系肺癌Calu-1细胞系购自中国科学院上海细胞库。

1.3肿瘤上清液的制备取对数生长期达到80%融合的肿瘤细胞，采用无血清的DMEM培养，37℃，5%CO2条件下孵育24 h，然后离心并收集上清液，将以1∶4的比例与DMEM混匀备用。

1.4苏拉明对LEC管腔形成能力影响的检测首先收集已贴壁的LEC，然后将收集的LEC以5×105/孔的细胞密度接种在事先涂有Matrigel的24孔板中，加入不同浓度(0、100、200、400 μg/ml)的苏拉明后作用48 h后，应用倒置显微镜观察LEC形成管腔的情况。每孔随机选取5个视野，并计数形成管腔的数目，计算平均值。

1.5肿瘤上清液对LEC管腔形成能力影响的检测首先收集已贴壁的LEC，然后将收集的LEC以5×105/孔的细胞密度接种在事先涂有Matrigel的24孔板中，分别加入为0%、10%、20%、40%体积分数的肿瘤细胞上清液，作用48 h后，应用倒置显微镜观察LEC形成管腔的情况。每孔随机选取5个视野，并计数形成管腔的数目，计算平均值。

1.6苏拉明对肿瘤上清液诱发的LEC管腔形成能力的影响首先收集已贴壁的LEC，然后将收集的LEC以5×105/孔的细胞密度接种在事先涂有Matrigel的24孔板中，加入体积分数为40%肿瘤细胞上清液的DMEM。作用12 h后，再分别加入不同浓度0、100、200、400 μg/ml的苏拉明后，继续培养48 h，应用倒置显微镜观察LEC形成管腔的情况。每孔随机选取5个视野，并计数形成管腔的数目，计算平均值。

1.7统计学方法采用SPSS11.0软件，计量资料组间比较采用t检验。

2结果

2.1苏拉明对LEC管腔形成能力的影响随着苏拉明浓度的增加，LEC的管腔形成数量没有明显变化0、100、200、400 μg/ml的苏拉明作用后，LEC的管腔形成数量分别为2.333 3±0.816 5，3.133 3±0.516 4，2.566 7±0.169 1，2.666 7±1.211 1。经统计学分析，结果显示各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明苏拉明对LEC管腔形成能力没有影响。见图1。

图1　苏拉明对LEC的管腔形成能力的影响(×100)

2.2肿瘤上清液对LEC管腔形成能力的影响通过成管实验研究显示，随着肿瘤上清液体积分数的增加，LEC的管腔形成数量明显增多，0%、10%、20%、40%体积分数组LEC管腔形成个数分别为2.333 3±0.816 5，4.333 3±0.516 4，6.166 7±1.169 1，7.666 7±1.211 1。结果显示各组间具有显著差异(P<0.05)，说明肿瘤上清液对LEC管腔形成能力有促进作用，呈浓度依赖性。见图2。

图2　肿瘤上清对LEC管腔形成能力的影响(×100)

2.3苏拉明对肿瘤上清液诱发的LEC管腔形成能力的影响见图3。通过成管实验研究显示，随着苏拉明浓度的增加，肿瘤上清液诱发的LEC的管腔形成数量逐渐减少，0、100、200、400 μg/ml苏拉明作用后，LEC管腔形成个数分别为6.666 7±1.505 5，3.600 0±0.894 4，2.430 0±0.286 8，1.930 0±0.156 0。结果显示各组间具有显著差异(P<0.05)，说明苏拉明对肿瘤上清液诱发的LEC管腔形成能力有抑制作用，并呈剂量依赖性。

图3　苏拉明对肿瘤上清液诱发的LEC管腔 形成能力的影响(×100)

3讨论

侵袭和转移是恶性肿瘤患者致死的主要原因。淋巴管是实体肿瘤转移的最早通路之一，也是影响预后的重要因素。研究表明，肿瘤周围区的淋巴管有数量上的改变，增加了肿瘤细胞淋巴道转移的机会。鉴于肿瘤淋巴管生成在肿瘤转移(尤其淋巴道转移)及肿瘤细胞代谢过程中起着极其重大的作用，研发和应用淋巴管生成抑制剂对抑制肿瘤的局部淋巴管生成意义重大。通过抑制肿瘤的局部淋巴管生成，阻断了肿瘤的淋巴道转移途径，可以使肿瘤病患病情恶化的概率降低，生活质量得到提升，最终达到延长病患生存期的目的。当前，随着对肿瘤淋巴管生成机制的深入研究，抗淋巴管生成治疗逐步成为抗肿瘤治疗中一个新的研究方向。

苏拉明作为抗肿瘤药已经作用于临床〔4～6〕。研究发现，应用苏拉明抗肿瘤效果较为明显，苏拉明与其他抗肿瘤药还具有协同作用。苏拉明不但能抑制肿瘤细胞的增殖，而且能够通过阻断生长因子(如VEGF、TGF、PDGF、IGF等)与其受体的相互作用，抑制肿瘤血管的生成〔7〕，达到减少肿瘤组织营养供应，从而抑制肿瘤生长。然而，苏拉明对肿瘤细胞诱发的肿瘤淋巴管生成，特别是苏拉明对淋巴管内皮细胞的增殖和管腔形成能力的影响却未见报道。

本实验通过肿瘤上清液作用于淋巴管内皮细胞模拟体内肿瘤状态下的淋巴管内皮细胞状态，进而观察苏拉明对肿瘤上清液诱导的淋巴管内皮细胞管腔形成能力的影响。结果表明，随着肿瘤上清液体积分数的增加，淋巴管内皮细胞的管腔形成能力逐渐增强。这表明肿瘤细胞可能是通过释放一些细胞营养因子这种方式来改变淋巴管内皮细胞的生物学状态，从而影响其功能。同时，也发现苏拉明能抑制这种肿瘤上清液诱发的淋巴管内皮细胞管腔的形成，而苏拉明对淋巴管内皮细胞管腔形成则没有明显影响。这些结果说明苏拉明可能通过阻断由肿瘤细胞所引起的淋巴管内皮细胞活性增强从而达到抑制肿瘤转移的作用。

当然苏拉明对淋巴管内皮管腔形成能力的影响是否还有其他作用机制，还需进一步实验证明。本实验只是初步的细胞水平实验，有待进一步的深入研究及动物实验验证。

4参考文献

1Krishnan J，Kirkin V，Steffen A，etal.Differential in vivo and in vitro expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)-C and VEGF-D in tumors and its relationship to lymphatic metastasis in immunocompetent rats〔J〕.Cancer Res,2003；63(3)：713-22.

2Padera TP，Kadambi A，di Tomaso E，etal.Lymphatic metastasis in the absence of functional intratumor lymphatics〔J〕.Science，2002；296 (5574)：1883-6.

3徐永良.苏拉明对肿瘤上清液诱导的淋巴管内皮细胞增殖的影响〔J〕.牡丹江医学院学报，2013;1：3-5.

4Kawakami M，Furuhata T，Kimura Y，etal.Quantification of vascular endothelial growth factor-C and its receptor-3 messenger RNA with real-time quantitative polymerase chain reaction as a predictor of lymphnode metastasis in human colorectal cancer〔J〕．Surgery，2003;133(3)：300-8.

5Schacht V，Ramirez MI，Hong YK，etal.T1〔alpha〕/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema〔J〕.EMBO J，2003;22(14)：3546-56.

6王海东，景涛，杨康,等.苏拉明对食管癌血管生成抑制作用研究〔J〕.消化外科，2005;4(1)：59-61.

7Hall FT，Freeman JL，Asa SL，etal.Intratumoral lymphatics and lymph node metastases in papillary thyroid carcinoma〔J〕.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2003;129(7)：716-9.

〔2015-04-15修回〕

(编辑曲莉)