盐霉素对低分化鼻咽癌干细胞放疗敏感性的影响

盐霉素对低分化鼻咽癌干细胞放疗敏感性的影响

甘生敏罗超李娟刘双李亚军李少林彭志平

(重庆医科大学基础医学院放射医学与肿瘤学教研室,重庆400016)

摘要〔〕目的探讨盐霉素对低分化鼻咽癌干细胞放疗敏感性的影响。方法将鼻咽癌干细胞悬液放入标有1～24的孔板中培养，其中1～12为对照组，13～24为实验组，其中向对照组加入200 μl的PBS缓冲液，向实验组加入200 μl终浓度为2 μmol/L的盐霉素，适宜环境中培养12 h后，两组细胞均给予6 Gy单次照射，放疗结束后，接种至培养皿中常规培养2 w，GIEMSA染色，计算细胞存活分数(SF)，采用RT-PCR及 Western印迹法检测选取培养24 h后人鼻咽癌干细胞中Rad51、Ku70、Ku80基因及蛋白表达水平。结果实验组培养皿中细胞SF明显低于对照组(P<0.05)。实验组培养皿鼻咽癌干细胞Rad51、Ku70和Ku80 mRNA表达水平低于对照组(P<0.05)。实验组培养皿鼻咽癌干细胞Rad51、Ku70和Ku80蛋白表达水平明显低于对照组(P<0.05)。结论盐霉素能够明显抑制人低分化鼻咽癌干细胞中Rad51、Ku70和Ku80表达，降低细胞存活分数，提高放疗敏感性和临床疗效。

关键词〔〕盐霉素；鼻咽癌；放疗；敏感性

中图分类号〔〕R739.63〔

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81171365)

通讯作者：彭志平(1971-)，男，副教授，硕士生导师，主要从事肿瘤放射治疗临床及基础研究。

第一作者：甘生敏(1987-)，女，硕士,医师，主要从事肿瘤放射治疗学研究。

Effects of salinomycin on radiation sensitivity of low differentiation nasopharyngeal carcinoma stem cells

GAN Sheng-Min, LUO Chao, LI Juan,etal.

Department of Radiation Medicine and Oncology, Basic College of Chongqing Medical Universtiy, Chongqing 400016, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of salinomycin on radiation sensitivity of low differentiation nasopharyngeal carcinoma stem cells.MethodsNasopharyngeal carcinoma stem cell suspension were put into orifice plate marked with 1～24, plated with 1～12 were selected as the control group, with 13～24 were selected as the experimental group. 200 μl PBS were added into control group, 200 μl salinomycin (concentration was 2 μmol/L) were added into experimental group. Cells were cultured into suitable environment for 12 h, and were given 6 Gy single radiation therapy. After radiation therapy, cells were cultured into petri dish for 2 weeks. Cell survival fraction (SF) was calculated by GIEMSA staining, Rad51, Ku70, Ku80 gene and protein expression were detected by RT-PCR and Western blot after cultured 24 h.ResultsSF in experimental group was lower than that of control group (P<0.05). Expression of Rad51, Ku70, Ku80 mRNA in experimental group were lower than those of control group (P<0.05). Expression of Rad51, Ku70, Ku80 protein in experimental group were lower than those of control group (P<0.05).ConclusionsSalinomycin could significantly inhibit the expressions of Rad51, Ku70 and Ku80 in low differentiation nasopharyngeal carcinoma cells, reduce the SF, improve radiation sensitivity and clinical curative effect.

【Key words】Salinomycin; Nasopharyngeal carcinoma; Radiation therapy; Sensitivity

鼻咽癌(NPC)是我国常见发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤〔1〕。本病临床表现为鼻塞、涕血、鼻出血、耳闷堵感、听力下降、头痛、复视等〔2〕。本病多发于中老年人群，其发病与遗传因素、病毒感染及环境因素关系密切。鼻咽癌是多因素、多效应、多基因和多阶段共同作用的结果〔3〕。鼻咽癌是目前能够治愈的恶性肿瘤之一，绝大多数鼻咽癌对放疗较敏感，因此现代医学中是以放疗为主，化疗及手术为辅助的治疗手段。随着医疗工作者对鼻咽癌探索，更加注重提高本病的放疗敏感性，有相关资料证明，盐霉素具有抑制肿瘤干细胞的作用，其抑制乳腺癌肝细胞比抗癌药泰克索高出百倍〔4〕。为了研究盐霉素对鼻咽癌放疗的敏感性，本研究检测鼻咽癌干细胞中的Rad51、Ku70和Ku80的表达情况，探讨盐霉素对低分子鼻咽癌干细胞放疗敏感性的影响。

1资料与方法

1.1一般资料人低分化鼻咽癌干细胞株由本实验室构建，盐霉素、DMEM/ F12培养基、胎牛血清(FBS)、RMPI1640培养基、青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 U/ml)(Gibco公司)，表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)(Peprotech公司)，B27(Invitrogen公司)，Accutase(Gibco公司)，Cell Culture Inserts(Thermo公司)，Trizol试剂购于购于美国Hyclone公司；RT-PCR试剂盒、超纯RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒均购于美国Amresco公司；Rad51抗体、Ku70抗体、Ku80抗体、引物、Tap酶和DAB显色剂购于美国BD bioscience公司。X线直线加速器：美国Varian 23EX。RMPI1640培养基中加入10%的FBS和双抗配制成完全培养液(SSM)。DMEM/F12培养液中加入双抗、20 ng/ml EGF、20 ng/ml bFGF、2%的B27，配制成无血清培养液(SFM)。盐霉素溶于DMSO(2 mmol/L)。

1.2鼻咽癌细胞培养及处理方法无菌操作下，取人低分子鼻咽癌干细胞株置于SSM(含血清的1640培养基)培养基中，置于37℃，体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养，每3天半量换液1次，待细胞生长至80%左右时，传代培养，传代时将细胞微球收集至离心管中，自然沉降20 min或800 r/min离心3 min，机械吹打成单细胞悬液，按1∶3传代至新的培养瓶中，再每瓶分别加入3～5 ml新鲜SFM培养基，继续培养。照射方法：6MV-X，机架旋转180°，射野10×10 cm，源皮距(SSD)100 cm，剂量率200 cGy/min。照射时培养板下放置1.5 cm厚等效组织补偿物，待细胞静置20 min后开始照射。

取对数生长期的低分化鼻咽癌干细胞，机械吹打成单细胞悬液，离心，收集后，加入10%体积分数的RPMI-1640培养基中，配制成细胞悬液，在预先准备好的24孔板(标有1～24数字，其中1～12为对照组，13～24为实验组)内加入200 μl浓度为4×104/ml的鼻咽癌干细胞悬液，置于37℃体积分数为5%的CO2饱和湿度环境中培养，接种12 h后，待24孔板细胞贴壁后，抽取并除去培养液，向实验组加入终浓度为2 μmol/L的盐霉素，相应对照组加入等量的PBS缓冲液。培养24 h后，两组细胞均给予6 Gy单次照射，放疗结束后，收集细胞，离心，机械吹打成单细胞悬液，将对照组细胞接种至A培养皿中，实验组细胞接种至B培养皿中，添加SFM培养基，将A、B两培养皿移入37℃、5%CO2培养箱中培养，常规培养2 w后终止培养，去除培养基，用PBS缓冲液浸洗2次，甲醇固定，GIEMSA染色，空气干燥。计算细胞存活分数(SF)。

1.3RT-PCR法检测人低分子鼻咽癌干细胞中Rad51、Ku70、Ku80基因表达水平

1.3.1总RNA的提取分别取A、B两培养皿人低分子鼻咽癌干细胞于0.2%胶原酶中消化，采用D-Hanks液清洗，置于4℃水中冰浴30 min，1 200 r/min离心8 min，制备成单细胞沉淀，向单细胞沉淀中加入1 ml Trizol试剂，采用超纯RNA提取试剂盒提取人鼻咽癌干细胞中总RNA。实验操作按产品说明书进行，用紫外分光光度法测定RNA的OD260/OD280确定总RNA纯度。

1.3.2反转录聚合酶链反应根据逆转录试剂盒要求进行反转录反应操作，按照相关文献资料设计聚合酶链反应(PCR)中内参照Rad51、Ku70、Ku80和GAPDH引物，将RNA模板、引物、5倍缓冲液和RNase-free水溶解并置于冰上备用，将2 μl Primer mix试剂和10 μl消化后RNA分别加入20 μl反应体系的第一部分，混匀。PCR反应体系为：稀释后Template(cDNA)2 μl，正义链Primer(10 μmol/L)0.8 μl，SYBR Premix Ex Taq TMⅡ(2×)10 μl，反义链Primer(10 μmol/L)0.8 μl，ROX Reference Dye(50×)0.4 μl，dH2Oto final volume To 20 μl。经过PCR反应条件的优化，PCR循环条件为94℃30 s，57℃20 s，72℃27 s，共35个循环，最后72℃再延伸5 min。引物序列见表1。

1.3.3结果分析PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，溴乙啶染色，通过成像分析scion软件计算和比较Rad51、Ku70和Ku80产物条带的吸光度值，并与GAPDH条带光密度值比较，计算出Rad51、Ku70和Ku80在人鼻咽癌干细胞中mRNA表达含量相对值。

1.4Western印迹法检测人鼻咽癌干细胞中Rad51、Ku70和Ku80蛋白表达无菌操作下，分别取A、B两培养皿人鼻咽癌干细胞，将选取好的人鼻咽癌干细胞经PBS缓冲液洗涤，洗涤后离心收集，用冰冷PBS洗涤细胞3次后，加入裂解缓冲液，摇匀，置于4℃水中冰浴30 min，1 200 r/min离心10 min，吸取上清液，即胞质蛋白。采用BCA法对样品蛋白质进行蛋白定量。调整样品蛋白量为30～40 μg后进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，并将蛋白质转移到PVDF膜上。PBST洗膜5 min后，PBST溶解封闭PVDF膜2 h。继而加入Rad51抗体、Ku70抗体、Ku80抗体(按1∶1 000稀释)或抗β-actin(1∶2 000稀释)，置于4℃环境中过夜。PBST洗涤3次，每次10 min，加入二抗，温室孵育2 h。再次用PBST洗涤3次，每次10 min。将PVDF膜ECL显色，在暗室中将PBVF曝光于X光片中，用凝胶成像系统扫描分析结果。

表1　目的基因的实时定量RT-PCR引物序列

1.5统计学方法采用SPSS17.0软件进行t检验。

2结果

2.1两组培养皿中人低分子鼻咽癌干细胞Rad51、Ku70和Ku80 mRNA表达及SF比较实验组培养皿人低分子鼻咽癌干细胞Rad51、Ku70和Ku80 mRNA表达水平及SF明显低于对照组(P<0.05)。见表2，图1。

表2　人鼻咽癌干细胞Rad51、Ku70和Ku80 mRNA

与对照组比较：1)P<0.05，下表同

图1　人低分子鼻咽癌干细胞Rad51、Ku70和 Ku80产物琼脂糖凝胶电泳图

2.2两组培养皿中人低分子鼻咽癌干细胞Rad51、Ku70和Ku80蛋白表达比较实验组培养皿人低分子鼻咽癌干细胞Rad51、Ku70和Ku80蛋白表达水平明显低对照组培养皿，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3，图2。

表3　人鼻咽癌干细胞Rad51、Ku70和

图2　鼻咽癌干细胞Rad51、Ku70和Ku80 蛋白表达

3讨论

鼻咽癌是我国高发恶性肿瘤之一，发病率为耳鼻喉恶性肿瘤之首，是鼻咽腔顶部及侧壁恶性病变而发生的恶性肿瘤，常常导致鼻塞、鼻出血、听力下降、复视、头痛等症状，严重影响患者生活质量。绝大多数病理类型的鼻咽癌因对放射治疗有较强敏感度，故目前临床鼻咽癌以放射治疗为主要，化学治疗及手术治疗为辅助治疗的治疗策略〔5〕。随着医疗技术的发展，探索提高本病放疗的敏感性是目前的重点研究方向。研究表明，盐霉素在抑制乳腺癌干细胞上比普通的抗癌药物高出100倍〔6〕。 放射线治疗是使用放射线对肿瘤细胞DNA的损伤，主要是DSBs的损伤，而放射敏感性也主要与放射治疗后细胞DSBs损伤的修复程度〔7〕。放射治疗后细胞DSBz的修复途径主要由两条〔8〕，一是通过HR修复，二是通过NHEJ修复，而HR修复是细胞DSBs修复的主要修复机制，Rad51蛋白是HR修复机制中必不可少的元素〔9〕；在NHEJ修复途径中，DNA-PK是参与修复过程中的重要分子之一，而DNA-PK是由DNAP-PKCs和Ku70、Ku80共同催化调节而成，并且辅助因子Ku70、Ku80在DSBs修复过程中国起到重要的作用〔10〕。当细胞中Rad51、Ku70和Ku80缺乏时，细胞DSBs修复能力明显下降，从而增强放射治疗对肿瘤细胞的杀伤力〔11〕。本研究中，盐霉素处理后的低分子鼻咽癌干细胞经过6 Gy放疗后，细胞中Rad51、Ku70和Ku80的mRNA和蛋白水平与单纯接受放疗的低分子鼻咽癌干细胞基因和蛋白表达水平明显下调，且细胞SF亦明显下降。Rad51是HR修复途径的重要因子，采用盐霉素处理后，Rad51表达明显下调，盐霉素可能是通过抑制Rad51蛋白的表达，抑制DSBs修复的主要HR修复途径〔12〕；Ku70和Ku80是NHEJ重要参与分子，通过盐霉素处理后，鼻咽癌干细胞中Ku70和Ku80表达明显下调，这可能与盐霉素能够抑制NHEJ修复途径，进而抑制细胞DSBs的修复〔13，14〕。盐霉素通过抑制DSBs修复途径中的重要因子的表达，从而发挥抗肿瘤的作用，增强放疗对低分子鼻咽癌的放疗敏感。

综上所述，盐霉素抑制鼻咽癌干细胞中Rad51、Ku70和Ku80蛋白的表达，抑制细胞DSBs修复途径，从而增强放射治疗对鼻咽癌干细胞DNA的损伤，发挥抗肿瘤的作用，提高低分子鼻咽癌干细胞对放疗敏感性，提高鼻咽癌的临床治疗疗效，改善预后。对鼻咽癌临床治疗及其预后有重要指导意义。

4参考文献

1刘华英，彭淑平，周鸣，等.鼻咽癌的表观遗传学研究进展〔J〕.生物化学与生物物理进展，2007；34(7)：673-81.

2李军，汤敏中，陆爱英，等.鼻咽癌患者血清MIP-3α与cystatin A表达及其临床意义〔J〕.中国癌症杂志，2013；(10)：845-51.

3Gao Y，Zhu SY，Dai Y,etal.Diagnostic accuracy of sonography versus magnetic resonance imaging for primary nasopharyngeal carcinoma〔J〕.J Ultrasound Med，2014；33(5)：827-34.

4Zhang SX，Han PH，Zhang GQ,etal.Comparison of SPECT/CT，MRI and CT in diagnosis of skull base bone invasion in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Biomed Mater Eng，2014；24(1)：1117-24.

5Paylakhi SH，Moazzeni H，Yazdani S,etal.FOXC1 in human trabecular meshwork cells is involved in regulatory pathway that includes miR-204，MEIS2，and ITGβ1〔J〕.Exp Eye Res，2013；111(1)：112-21.

6Seo S，Singh HP，Lacal PM,etal.Forkhead box transcription factor FoxC1 preserves corneal transparency by regulating vascular growth〔J〕.Pro Nat Acad Sci USA，2012；109(6)：2015-20.

7Berry FB，Mirzayans F，Walter MA,etal.Regulation of FOXC1 stability and transcriptional activity by an epidermal growth factor-activated mitogen-activated protein kinase signaling cascade.〔J〕.J Biol Chem，2006；281(15)：10098-104.

8葛永斌，张宏，谢强，等.甲基转移酶与鼻咽癌放疗敏感性的相关性研究〔J〕.南方医科大学学报，2010；30(3)：620-1.

9李思维，何卓凯，白雪，等.Raf激酶抑制蛋白预测鼻咽癌放疗敏感性〔J〕.中华放射医学与防护杂志，2013；33(4)：380-3.

10李思维，郭翔，吕星，等.Raf-1蛋白预测鼻咽癌放疗敏感性的价值〔J〕.实用医学杂志，2012；28(1)：80-3.

11杨洁，祝淑钗.西妥昔单抗对鼻咽癌放疗敏感性的增强作用及机制〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(22)：5669-71.

12吴丹心，汪森明，张积仁，等.盐霉素诱导鼻咽癌CNE-2细胞凋亡及其作用机制的探讨〔J〕.实用医学杂志，2013；29(24)：3967-70.

13吴红伦，朱疆艳，王丽，等.沐舒坦联合糜蛋白酶在鼻咽癌放疗后鼻腔冲洗中的疗效分析〔J〕.实用医学杂志，2010；26(10)：1801-3.

14吴丹心，陈可绪，陈冬杰，等.盐霉素联合ApoG2诱导鼻咽癌CNE-2细胞凋亡的实验研究〔J〕.实用医学杂志，2014；24(19)：3062-5.

〔2013-12-29修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)