人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺结构与功能的影响

·基础研究·

人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺结构与功能的影响

冉瑞图孙嘉政张晶邵月张力恒李成鹏1贾道勇1张岩岩1张梦思1王亚平1

(重庆医科大学,重庆400016)

摘要〔〕目的探讨人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺结构与功能的影响及机制。方法SD大鼠随机分为4组，每组10只。衰老模型组，皮下注射D-半乳糖120 mg/kg，1次/d，42 d；Rg1衰老模型组，注射D-半乳糖剂量与时间同衰老模型组，第15天起腹腔注射Rg1 20 mg/kg，1次/d，28 d正常对照组，皮下注射生理盐水1次/d，42 d；Rg1正常对照组，注射生理盐水1次/d，14 d，第15天起腹腔注射Rg1(同Rg1衰老模型组)。模型复制或药物注射完成后第2天，取胸腺测定胸腺指数，石蜡切片观察胸腺形态学；衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测胸腺细胞衰老，CCK-8检测胸腺细胞对刀豆蛋白A刺激的增殖能力，ELISA检测胸腺细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF)-α、GM-CSF、白细胞介素(IL)-2与IL-6的能力，流式细胞术检测细胞活性氧(ROS)、胸腺细胞凋亡，硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)，酶学检测超氧化物歧化酶(SOD)，DTNB法测定谷胱甘肽(GSH)、氧化谷胱甘肽(GSSG)含量，Western 印迹检测细胞衰老相关蛋白p21、p53、Rb的变化。结果Rg1衰老模型组大鼠胸腺指数升高、胸腺皮质面积比例增加、胸腺细胞的增殖能力提高，凋亡率减少、SA-β-Gal阳性胸腺细胞百分率下降、TNF-α、GM-CSF、IL-2、IL-6的分泌能力明显提高、SOD活性明显提升；ROS和MDA含量下降；p53、p21、Rb蛋白表达有显著下调。结论D-半乳糖复制的衰老模型大鼠胸腺结构与功能损伤明显，人参皂苷Rg1对其致衰损伤有明确的保护作用，其机制可能与抑制氧化损伤和下调p16-Rb、p53/p21信号通路有关。

关键词〔〕人参皂苷Rg1；胸腺

中图分类号〔〕R329.5〔

基金项目：国家自然科学基金资助项目(30973818)；国家教育部博士导师基金(20125503110006)；重庆医科大学学生创新基金(201314)

通讯作者：王亚平(1956-)，男，教授，博士生导师，主要从事干细胞衰老研究。

Effect of Ginsenoside Rg1 on the thymus structure and function of aging model rats

RAN Rui-Tu,SUN Jia-Zheng,ZHANG Jing,etal.

Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of ginsenoside Rg1 on the thymus structure and function of aging model rats and its relative mechanism. Methods40 SD rats were randomly divided into normal control,Rg1 control,aging model and Rg1 aging model groups. After 2 days of finishing injections,the thymus index was measured,paraffin section were made to observe thymus microscopic structure. Senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) stain was used to detect aging thymocytes. The proliferative capacity of thymocytes stimulated with Concanavalin A (Con A) was measured by CCK-8.The contents of TNF -α,GM-CSF,IL-2 and IL-6 were detected by ELISA. The apoptosis of thymocytes and level of reactive oxygen species(ROS)were analyzed by flow cytometry(FCM). The content of malondialdehyde(MDA) was detected by thiobarbituric acid method,the level of superoxide dismutase (SOD) was detected by enzymatic assay. The expressions of GSH,GSSG were detected by DTNB method. The expressions of senescence-associated protein P53,P21,Rb were detected by Western blot. ResultsComparing with those of Rg1 aging model group,the thymus index,thymus cortex area proportion,the secretory capability of IL-2,TNF-α,GM-CSF,and IL-6,the active content of SOD were obviously increased. The percentage of SA-β-Gal positive thymocytes,apoptosis rate of thymocytes,the production of ROS,MDA were significantly decreased,the expressions of P53,P21,Rb were also significantly down-regulated. ConclusionsThe thymus structure and function are obviously induced senescence by treating with D-galactose,ginsenoside Rg1 has a significantly antiaging or protective effect on thymus injury.The mechanism may be Rg1 inhibiting oxidative stress and down-regulating p53/p21/Rb signaling pathway

【Key words】Ginsenoside Rg1; Thymus

1重庆医科大学组织胚胎学教研室

第一作者：冉瑞图(1992-)，男，临床医学七年制在读学生，主要从事干细胞衰老研究。

免疫系统衰退将导致机体免疫功能低下、组织器官损伤修复障碍、自身免疫性疾病和肿瘤发生率提高等相关疾病。祖国医学的 “气血理论”认为,正气是具有防御、修复损伤等功能的有形物质,可见，“气”与机体免疫功能密切相关。人参是中医临床“补气”要药，人参皂苷Rg1是人参重要的抗衰老成分。我们最近研究证明，人参皂苷Rg1可调控造血干细胞衰老〔1,2〕。推测人参皂苷Rg1可以调控或激活免疫系统功能。胸腺是机体的中枢免疫器官，在T细胞的培育中起到举足轻重的作用。本文探讨人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺结构与功能的影响及其机制，旨在阐释衰老机体免疫功能低下机制。

1材料与方法

1.1实验动物3月龄清洁级雄性SD大鼠40只，体重180～200 g，重庆医科大学实验动物中心提供〔合格证号SCXK(渝2007-0001)〕。饲养条件控制在20℃～25℃，自然照明，自由饮水和摄食。

1.2主要试剂人参皂苷Rg1(吉林宏久生物技术有限公司购买，纯度≥98.6%)；D-半乳糖、刀豆蛋白(Con)A(Sigma公司)；白介素(IL)-2、IL-6 、肿瘤坏死因子(TNF)-α、GM-CSF检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；RPMI-1640培养基(Gibco公司)；0.25%胰酶-EDTA、胎牛血清(Hyclon公司)；CCK-8试剂盒(上海七海复泰生物公司)；活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Cal)试剂盒(碧云天公司)； p53、p21、RB兔抗鼠多克隆抗体(Prointech公司)；羊抗兔二抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3大鼠衰老模型复制与给药〔3〕SD大鼠随机分4组，每组10只。衰老模型组，皮下注射D-半乳糖120 mg/kg，1次/d，42 d；Rg1衰老模型组，注射D-半乳糖剂量与时间同衰老模型组，第15天起腹腔注射Rg1 20 mg mg/kg，1次/d，28 d；正常对照组，注射等量生理盐水1次/d，28 d；Rg1正常对照组，注射等量生理盐水1次/d，42 d，第15天起腹腔注射Rg1(同Rg1衰老模型组)。

1.4胸腺指数测定与显微形态学观察模型复制或药物注射完成后第2天称各组大鼠体重(kg)，取出胸腺称湿重(mg)，测定胸腺指数(胸腺指数=胸腺湿重/体重)。取各组大鼠胸腺，4%多聚甲醛固定胸腺2 d，常规石蜡切片，HE染色，显微镜下观察连续切片，以Image J 软件计算胸腺皮质占胸腺组织切片的比例。

1.5SA-β-Gal酶染色检测胸腺细胞衰老情况制备胸腺冷冻组织切片，SA-β-Gal酶染色固定液固定15 min,PBS液洗涤3次，加SA-β-Gal染色液，置37℃培养箱中孵育12～16 h,显微镜下观察着蓝色阳性细胞，计算各组大鼠衰老胸腺细胞百分比。

1.6胸腺细胞对ConA刺激的增殖能力研磨各组胸腺，通过400目铜网滤过胸腺残余组织，制备胸腺细胞悬液。将悬液移至离心管中,1 000 r/min×5 min， PBS重悬细胞,加淋巴细胞分离液分离计数胸腺细胞。按每孔5×103细胞 /200 μl 接种于96孔板中，每孔加终浓度5 μg/ml的ConA，每组设置5个复孔，设立空白对照孔调零。分别培养0、1、2、3、4 d，各孔加10 μl CCK-8，酶标仪(450 nm波长)测定吸光度值(A值)，评价胸腺细胞对ConA刺激的增殖能力。

1.7ELISA检测胸腺细胞分泌TNF-α、GM-CSF、IL-2、IL-6的能力按1.6方法制备和计数胸腺细胞，调整细胞浓度后接种于12孔板中，每孔加2 ml细胞悬液(含2×106个胸腺细胞),同时加入终浓度为5 μg/ml的ConA，培养48 h,离心收集培养上清，按照试剂盒说明书检测各组培养上清中IL-2、IL-6、TNF-α、GM-CSF含量。

1.8细胞氧化及抗氧化能力检测收集1.6制备的各组胸腺细胞，加入1 ml的DCFH-DA于各组胸脏细胞培养瓶中，37℃ 孵育 25 min，培养液洗涤细胞3次，流式细胞术检测胸腺细胞内ROS水平，以 DCF 的平均荧光强度表示其含量。收集细胞培养上清液，黄嘌呤氧化酶学法检测SOD，硫代巴比妥酸比色法检测MDA的含量，DTNB法测定谷胱甘肽(GSH)、氧化谷胱甘肽(GSSG)含量。

1.9胸腺细胞凋亡比例检测收集实验1.6培养的胸腺细胞,用预冷的 PBS 洗涤细胞 2次,调整细胞浓度为1×106/ml,加入AnnexinV -FITC 和50 μg/ml PI,摇匀后室温避光放置15 min,加入缓冲液后上流式细胞仪(Becton Dickinson，USA)检测，计算机分析胸腺细胞凋亡数据。

1.10衰老相关蛋白检测提取各组胸腺细胞总蛋白，调整蛋白浓度40 μg/泳道，12%SDS-PAGE凝胶电泳分离，移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗p53、p21、Rb(均1∶200)、β-actin抗体(1∶4 000)4℃孵育过夜，洗膜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶5 000)室温孵育2 h，洗膜，ECL发光系统显色。用FluorSTM Multimager 图像分析仪，Quality-One4.11软件进行图像灰度扫描处理。

2结果

2.1人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺指数与组织形态学的影响衰老模型组胸腺指数明显下降，Rg1衰老模型组胸腺指数显著增加，见表1。衰老模型组胸腺皮质变薄，皮质与髓质比例(6.8±0.9)明显减少；Rg1衰老模型组大鼠胸腺皮质增厚，皮质与髓质比例(7.5±1.2)明显增加，见图1。正常对照组与Rg1对照组胸腺皮髓质比例分别为9.2±1.2，10.1±1.5。

表1　人参皂苷Rg1对大鼠重量和胸腺指数的影响 ± s, n=10)

与正常对照组比较:1)P<0.05；2)P<0.01;与衰老模型组比较:3)P<0.05,4)P<0.01

图1　人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺组织形态的影响(HE染色，×200)

2.2人参皂苷Rg1对衰老大鼠SA-β-Gal阳性胸腺细胞影响胸腺细胞胞质呈蓝色为SA-β-Gal阳性细胞，着色深浅及着色面积与胸腺细胞衰老程度呈正相关。衰老模型组阳性细胞数显著增多〔(41.0±2.74)%〕，Rg1正常对照组SA-β-Gal阳性率为(21.8±2.58)%。对照组阳性细胞较少〔(19.0±3.54)%〕； Rg1衰老模型组阳性细胞数明显减少〔(28.1±1.58)%〕，提示Rg1能显著抑制衰老大鼠胸腺细胞的衰退。见图2。正常对照组SA-β-Gal阳星率为(21.8±2.58)%。

2.3人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺细胞增殖反应的影响衰老模型组大鼠胸腺细胞对丝裂原ConA的增殖反应能力明显降低， Rg1衰老模型组大鼠胸腺细胞对ConA增殖反应能力增强。见图3。

图2　人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺细胞衰老影响(SA-β-Gal染色，×400)

与正常对照组比较:1)P<0.05；与衰老模型组比较:2)P<0.05 图3　人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺细胞增殖反应的影响

2.4人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺细胞分泌TNF-α、GM-CSF、IL-2、 IL-6水平的影响衰老模型组胸腺细胞分泌TNF-α、GM-CSF、IL-2、 IL-6水平明显降低；Rg1衰老模型组胸腺细胞分泌IL-2、 IL-6水平显著上升、TNF-α、GM-CSF水平有所提高。见图4。

与正常对照组比较：1)P<0.01；与衰老模型组比较：2)P<0.05 图4　人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺细胞分泌细胞因子 水平的影响

2.5人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺细胞产生ROS、SOD、MDA水平的影响衰老模型组大鼠胸腺细胞产生ROS水平明显升高，MDA含量显著升高，SOD 活性显著下降，GSH/GSSH明显降低；Rg1衰老模型组大鼠胸腺细胞产生ROS水平明显降低，SOD 活性显著升高，MDA含量显著下降，GSH/GSSH升高。见表2，表3。

表2　人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺细胞产生ROS、

与正常对照组比较：1)P<0.01；与衰老模型组比较：2)P<0.01,3)P<0.05

表3　人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺细胞

与正常对照组比较:1)P<0.01；与衰老模型组比较:2)P<0.05

2.6人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺细胞凋亡的影响衰老模型组大鼠胸腺细胞凋亡率〔(31.4±1.24)%〕明显升高，Rg1衰老模型组大鼠胸腺细胞凋亡率〔(28.6±3.03)%〕下降。正常对照组及Rg1对照组胸腺细胞凋亡率分别为(22.0±1.5)%及(16.9±1.61)%。

2.7人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺细胞表达p21、p53、Rb蛋白的影响正常对照组胸腺细胞p21、p53、Rb蛋白低表达，衰老模型组大鼠胸腺细胞衰老相关蛋白p21、p53、Rb表达上调，Rg1对照组胸腺细胞中p21、p53、Rb蛋白表达量显著降低。衰老模型组p21、p53、Rb蛋白表达与正常对照组细胞相比明显升高，与Rg1衰老模型组胸腺细胞中p21、p53、Rb蛋白表达量比较有所降低，见表4，图5。

表4　人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺细胞p53、p21、Rb

与正常对照组比较:1)P<0.05；与衰老模型组比较:2)P<0.05

1.正常对照组;2.Rg1对照组;3.衰老模型组;4.Rg1衰老模型组 图5　人参皂苷Rg1对衰老大鼠胸腺细胞表达 p53、p21、Rb蛋白的影响

3讨论

D -半乳糖是目前公认的致衰剂，可以用于动物衰老模型的复制〔4〕。本研究采用D -半乳糖皮下注射42 d成功复制大鼠衰老模型，衰老模型大鼠胸腺重量，胸腺指数、胸腺皮质与髓质的面积比例、胸腺细胞对ConA的增殖反应均明显下降，胸腺细胞分泌TNF-α、GM-CSF、IL-2，IL-6能力显著下降，胸腺细胞SA-β-Gal染色阳性率以及凋亡率增加，结果提示，D -半乳糖建立的衰老动物模型可导致大鼠胸腺结构与功能损伤，可用于免疫器官衰退相关生物学研究。

胸腺重量和胸腺指数是代表胸腺大体形态的重要指标，胸腺皮质是胸腺组织学的实质结构，其形态结构能反映器官的机能状态。我们在复制衰老大鼠模型时，从第15天起给大鼠腹腔注射Rg1干预。结果发现，注射Rg1能明显减轻衰老模型大鼠胸腺萎缩程度，提高胸腺指数和胸腺皮质面积比例，提示Rg1能拮抗D-半乳糖对胸腺结构的破坏，可用于临床保护和延缓免疫器官衰老。

胸腺是T细胞分化、发育、成熟的场所，研究胸腺细胞的功能状态是反映胸腺功能的直接证据。本研究结果表明，Rg1能阻止D -半乳糖诱导的胸腺细胞衰老，并能促进胸腺细胞增殖和激活胸腺细胞功能。

氧化应激衰老机制认为，细胞内ROS水平增加和抗氧化能力下降是导致细胞衰老的关键因素〔5〕。ROS一方面可攻击细胞膜中的多不饱和脂肪酸，形成过氧化脂质；另一方面可作为细胞信号转导和基因表达调控分子，对细胞增殖分化、细胞凋亡和细胞衰老具有调控作用。机体中SOD能有效清除生物氧化产生的超氧阳离子自由基。本实验结果证明，给衰老模型组大鼠注射Rg1，发现胸腺细胞产生ROS和MDA水平明显减少，SOD的活性和GSH/GSSG比例显著上升，提示Rg1可能通过抑制D-半乳糖所致的氧化损伤，进而延缓大鼠胸腺衰老。

p53-p21-Rb是重要的细胞衰老信号传导通路， p53蛋白参与细胞对DNA损伤的应答，在维持基因组的稳定性中起“分子警察”作用〔6〕。p53的激活可上调p21的表达，从而抑制CDK2/Cyclin E复合物的活性，进而阻止细胞从G1期向S期转变〔7〕。p21还可通过抑制细胞CDK活性，从而抑制Rb和转录因子(E2F)的磷酸化过程，进而诱导细胞的生长停滞。本实验发现，衰老模型组大鼠胸腺细胞p53、p21、Rb蛋白表达增加。注射人参皂苷Rg1能显著降低衰老模型组大鼠胸腺细胞p53、p21、RB蛋白的表达。推测Rg1可以下调p53-p21-Rb衰老信号通路，这可能是Rg1延缓大鼠胸腺衰老或损伤机制之一。

4参考文献

1周玥,杨斌,姚欣,等.人参皂苷Rg-1延缓造血干细胞衰老与p16～(INK4a)表达关系的研究〔J〕.中国中药杂志,2011；36(5):608-13.

2崔巍，赵洪艳，王燕嬉.人参皂甙抗衰老的研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2006；26(17)：1578-81.

3彭彬,陈茂山,蒲莹,等.人参皂苷Rg1延缓D-半乳糖大鼠脑衰老作用及机制的初步研究〔J〕.重庆医科大学学报,2011；4:419-22.

4Gorczynski RM,Terzioglu E.Aging and the immune system〔J〕.Int Urol Nephrol,2008；40(4):1117-25.

5Droge W.Free radicals in the physiological control of cell function〔J〕.Physiol Rev,2002；82(1):47-95.

6Chen X,Zhang W,Gao Y,etal.Senescence-like changes induced by expression of p21(waf1/cip1)in NIH3T3 cell line〔J〕.Cell Res,2002；12(3-4):229-33.

7Jackson JG,Pereira-Smith OM.p53 is preferentially recruited to the promoters of growth arrest genes p21 and GADD45 during replicative senescence of normal human fibroblasts〔J〕.Cancer Res,2006;66(17):8356-60.

〔2014-11-19修回〕

(编辑李相军)

《中国老年学杂志》被国际数家数据库、检索性期刊检索机构收录情况

根据国际检索机构给中国科学技术期刊编辑学会国际交流工作委员会、中国高等学校自然科学学报研究会对外联络委员会发来的电子邮件及其附件统计整理, 《中国老年学杂志》2009年又被4种国际重要检索系统列为来源期刊:

1)美国化学文摘(CA)，CODEN ZLZHAO，http://www.lib.dlut.edu.cn/layersec.asp；

2)波兰《哥白尼索引》(IC, Index of Copernicus), http://journals.indexcopernicus. com/karta. Php;

3)日本《科学技术社(中国文献数据库)》(JST, Japan Science & Technology Agency) (Chinese Bibliographic Database);

4)美国《乌利希期刊指南》(UPD,Ulrich′s Periodicals Directory), http://www. ulrichsweb. com/ ulrichsweb/