HSD17B10、ALDH9A1、ALDH2、PRDX4在脑膜瘤蛋白质组学中的上调表达

HSD17B10、ALDH9A1、ALDH2、PRDX4在脑膜瘤蛋白质组学中的上调表达

崔广强矫爱红1刘爱娜1陈剑1邹鹏刘杰陈鸿光张洪涛张在强吴鑫汤国太

(烟台毓璜顶医院神经外科，山东烟台264000)

摘要〔〕目的探讨人脑膜瘤的发病机制。方法以人脑膜瘤组织和配对瘤旁正常蛛网膜组织为研究材料，采用蛋白质组学技术筛选脑膜瘤相关蛋白质。应用GO进行数据分析。结果鉴定出4个具有氧化还原酶活性的上调表达蛋白。结论该研究揭示了脑膜瘤蛋白质组中的4个具有氧化还原酶活性的上调表达蛋白，为进一步研究脑膜瘤的发生和发展分子机制提供了初步数据。

关键词〔〕脑膜瘤；蛋白质组学；差异蛋白 GO分析

中图分类号〔〕R6〔

基金项目：烟台市科技发展计划(2013WS214)

1烟台毓璜顶医院肿瘤内科

第一作者：崔广强(1977-)，男，主治医师，主要从事脑肿瘤、脑外伤、脑血管疾病研究。

在生命科学研究中发现，只有2%的疾病是由基因序列决定的，而98%的疾病发生与蛋白质表达相关〔1〕。因此，蛋白质组学研究对于揭示疾病发生、发展的分子机制具有重要意义。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1标本10例新鲜人脑膜瘤组织及其配对的瘤旁正常蛛网膜组织取自烟台毓璜顶医院神经外科的未经放疗、化疗的脑膜瘤手术切除标本，并经病理诊断确诊均为WHO I级。肿瘤组织来源患者情况：年龄42～70岁，平均55岁；男4例，女6例。实验操作得到伦理委员会批准。

1.1.2实验试剂和主要实验仪器试剂：过硫酸铵、Tris等购自上海生工；二氟乙酸(TFA)购自于Fluka，羟基内桂酸(CHCA)质谱标准品多肽购自Sigma公司；ACN购自Fisher公司；胰酶购自Promega(Madison，WI，USA)，固相pH梯度(IPG)胶条等购自美国通用电器(GE Healthcare)公司。主要实验仪器：等电聚焦电泳仪(Ettan IPGphor Ⅱ，GEHealthcare)；垂直电泳仪(Ettan DALT twelve，GEHealthcare)；凝胶扫描仪(PowerLook2100XL，Umax)；凝胶图像分析软件(PDquest，Biorad)；基质辅助激光解析飞行时间质谱仪(ABI 4700，ABI)。

1.2方法

1.2.1组织标本的处理手术切除的脑膜瘤样本10例及其配对的瘤旁正常蛛网膜组织。手术切取后，去除血块、纤维组织等，即刻放入液氮中，然后转入-80℃保存。

1.2.2组织总蛋白制备将脑膜瘤和正常脑膜组织剪碎，使用GE Healthcare公司的“Sample grinding kit”研磨样品。

1.2.3蛋白定量根据定量蛋白浓度，将所有脑膜瘤和正常脑膜分别等量混合，组成脑膜瘤和正常脑膜样品的样本池。蛋白纯化：加入相当于4倍体积的丙酮，缓慢混匀，在冰上静置2 h，使蛋白充分沉淀，4℃，12 000 r/min离心10 min；弃上清，并加入适量的普通双向裂解液，缓慢溶解2 h，12 000 r/min离心30 min，得到的上清为纯化后蛋白样品。

1.2.4双向电泳第一向等电聚焦电泳(IEF)：样品500 μg与水化液混合，胶内溶胀上样，予20℃进行在Ettan IPGphor Ⅱ上进行等电聚焦电泳。平衡：完成等电聚焦后，分别把 IPG 胶条置入15 ml含有1%(W/V)二硫苏糖醇(DTT)平衡液中，振荡15 min。再把胶条放入15 ml含有2.5%碘乙酰胺(IAA)(W/V)的平衡液中烷基化15 min。 第二向十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺酸胶(SDS-PAGE)电泳：IPG胶条平衡后移至12.5%的均一凝胶上方，用含溴酚蓝的0.5%琼脂糖封顶。采用Ettan DALT twelve进行SDS-PAGE，电泳参数：第一步恒功率0.2 W/胶，1 h；第二步恒功率0.4 W/胶，1 h；第三步250 V恒压5 h，至溴酚蓝指示线跑至胶底缘时电泳结束。

1.2.5凝胶染色以考马斯亮蓝R350染色。配置储存液，在磁力搅拌器中搅拌，加速溶解5～10 min，加120 ml甲醇继续搅拌，至彻底溶解，终体积为200 ml，然后在通风橱中过滤。过滤好以后把染色储液存于4℃冰箱，使用前以20%乙酸1∶1配比，摇匀后即可以使用。染色时间需在24 h以上，去掉染色液后使用脱色液清洗凝胶数遍后即可获得背景清晰的染色效果。

1.2.6凝胶图像扫描和分析使用PowerLook 2100XL扫描仪对凝胶进行透射扫描，在300 dpi的分辨率下扫描凝胶从而获得图像。重复3次实验，用PDQuest 7.0凝胶图像分析软件依次进行凝胶点的检测、背景消减、匹配、归一化等各项分析。差异位点定义为各组间相对丰度差异2倍以上的位点。

1.2.7蛋白胶点的酶解首先使用枪头将胶点进行垂直切取，然后进行酶解。37℃水浴中将胶粒浸泡于脱色工作液中进行脱色，至胶粒蓝色褪尽。然后用100%乙腈脱水15 min，离心干燥10 min。再加胰蛋白酶溶液于4℃吸胀30 min。把多余的胰酶吸出后，加10 μl 25 mmol/L NH4HCO3于37℃酶解过夜。酶解完成后，首先用萃取液抽提肽段，于37℃保温1 h， 再将萃取的上清液转入到新的EP管中，离心机浓缩干燥。使用3 μl溶解液溶解干燥好的肽段，再进行质谱检测。

1.2.8质谱鉴定肽指纹图谱(PMF)数据采集在ABI 4700飞行时间质谱进行，质量范围为800～3 500 D，激光能量设置在4 000，每个质谱图由20个各含100次激光轰击的图谱合成。采用GPS Explorer 软件进行数据处理，其核心算法为MASCOT，检索时设定质量范围为800～3 500 D，图谱密度为每200 D不超过50个峰，信噪比20，检索数据库为SWISS-PROT，peptide tolerance设置0.15 D。

1.2.9质谱图谱数据分析采用PDQuest 7.0软件分析脑膜瘤组织和正常蛛网膜组织2-D 凝胶之间的差别。利用其注释功能凝胶图像上点的蛋白质有关信息进行注释。

1.3GO数据分析应用molecul annotation system 3.0软件进行GO数据分析。

2结果

本研究直接针对脑膜瘤组织，比较脑膜瘤组织和瘤旁正常蛛网膜组织蛋白表达差异，鉴定出26个在脑膜瘤组织上调表达蛋白：3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2，Peroxiredoxin-4，Aldehyde dehydrogenase，4-trimethylaminobutyraldehyde dehydrogenase，BTB/POZ domain-containing protein KCTD12，Chloride intracellular channel protein 1，Cofilin-1，Cytochrome b-c1 complex subunit 1,Glutathione S-transferase P，Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H，Hypoxia up-regulated protein 1，POTE ankyrin domain family member F，Profilin-1，Prohibitin，Proteasome subunit alpha type-2，Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-2-like 1，Phosphoglycerate kinase 1，40S ribosomal protein S12，Carbonic anhydrase 1，Phosphoglycerate mutase 1，Triosephosphate isomerase，N(G),N(G)-dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1，Phenazine biosynthesis-like domain-containing protein，Rho GDP-dissociation inhibitor 1，Tropomyosin alpha-4 chain，Glycine amidinotransferase。应用molecul annotation system 3.0软件对上调表达蛋白进行GO数据分析，得到4个具有氧化还原酶活性的上调表达蛋白，分别为HSD17B10;ALDH9A1;ALDH2;PRDX4，P<0.05。见表1。

表1　四个具有氧化还原酶活性的上调表达蛋白的基本数据

3讨论

蛋白质组学技术是一种广泛的蛋白表达谱扫描技术，可以解释细胞或组织中差异表达蛋白和特异性表达蛋白。近年来，一些研究证明特异的蛋白质组和蛋白表达方式可以区分人类脑部肿瘤的不同亚型和等级〔2〕。脑膜瘤起源于蛛网膜细胞，是颅内肿瘤中发病率最高的肿瘤之一。一般为良性，但是如果得不到有效的控制，会侵入脑组织，造成预后恶化的风险〔3〕。近年来，脑膜瘤分子生物学和遗传学方面的研究为人们提供了揭示脑膜瘤形成和发展分子机制的新途径〔4〕。

Tao等〔5〕收集选择了79例脑膜瘤手术患者的脑膜瘤组织，采用cDNA或组织微阵列技术对脑膜瘤的发病机制进行了研究，分析差异表达基因，发现其与血管发生、增殖和细胞凋亡信号通路有关。这些差异表达基因会导致细胞存活失衡，诱发肿瘤发生。Kim等〔6〕收集了4例脑膜瘤和4例非脑膜瘤病人的脑脊液，采用双向电泳联合质谱技术鉴定出了11个蛋白，其中Apo E、Apo J和AAT在脑膜瘤组织是上调表达，PTGDS、TTR和β2M在脑膜瘤组织下调表达。 这些蛋白可能是脑膜瘤的候选生物标记。

将这些蛋白应用molecul annotation system 3.0软件进行GO数据分析，得到4个具有氧化还原酶活性的上调表达蛋白。3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 又名17-β-Hydroxysteroid dehydrogenase X，是由HSD17B10(hydroxysteroid (17β) dehydrogenase 10)基因编码〔7〕。该蛋白是短链脱氢酶/还原酶超家族成员，是一个线粒体酶，可以催化多种脂肪酸、乙醇和类固醇的氧化〔8〕，与阿尔茨海默病的发展相关。抑制该蛋白表达会导致hydroxysteroid (17β) dehydrogenase X (HSD10)缺乏、心智发育迟缓、舞蹈手足徐动症和异常行为等〔9〕。本研究结果提示该蛋白与脑膜瘤的发生和发展可能相关。

4-trimethylammoniobutyraldehyde dehydrogenase是催化化学反应4-trimethylammoniobutanal + NAD++ H2O 4-trimethylammoniobutanoate + NADH+2H+的酶。该酶属于氧化还原酶家族，参与赖氨酸降解和肉毒碱的生物合成〔10〕。本研究结果显示该蛋白可能与脑膜瘤的发生和发展相关。

Aldehyde dehydrogenase是一类催化醛类氧化(脱氢)的酶〔11〕。该基因参与许多生物学过程，如清除外源和内源产生的醛类。它是一个多态酶，在醛类氧化成羧酸的过程中发挥重要作用。羧酸在肝脏中合成，在肌肉和心脏中被代谢〔12〕。该酶在许多组织中都有表达，在肝脏中的含量最高〔13〕。Yokoyama等〔14〕研究发现降低该酶的活性会导致食管癌的发病率增加。本研究发现该酶在脑膜瘤组织中表达上调，提示该酶在不同类型肿瘤中发挥不同的作用。

Peroxiredoxin-4是由PRDX4基因编码〔15〕。该蛋白是抗氧化物酶，属于peroxiredoxin家族。该蛋白存在于细胞质中，可以还原过氧化氢和烷基氢过氧化物，使其变成水和乙醇。有研究表明该蛋白可以调控转录因子(NF)-κB的激活〔15〕。本研究发现该蛋白在脑膜瘤组织中上调表达，提示其在脑膜瘤发生和发展过程中可能发挥重要作用。

综上所述，本研究采用蛋白质组学技术发现了4个具有氧化还原酶活性的上调表达蛋白。但要明确上述蛋白质是否是与脑膜瘤的发生和发展密切相关的特异蛋白质，还需进一步深入研究这些差异表达蛋白质的结构和功能。这些差异表达蛋白质为研究脑膜瘤发生、发展的分子机制提供了初步数据。

4参考文献

1Strohman R. Epigenesis the missing beat in biotechnology〔J〕. Biotechnology,1994;12(2):156-64．

2Vankalakunti M,Vasishta RK,Das Radotra B,etal.MIB-1 immunolabeling: a valuable marker in prediction of benign recurring meningiomas〔J〕. Neuropathology,2007; 27(5):407-12.

3Whittle LR. Meningiomas〔J〕. Lancet,2004;363(9420):1535-43.

4Wrobel G,Roerig P,Kokocinski F,etal.Microarray-based gene expression proling of benign,atypical and anaplastic meningiomas identifieses novel genes associated with meningioma progression〔J〕. Int J Cancer,2005;114(2):249-56.

5Tao Y,Wei Q,Xua Z,etal.Holistic and network analysis of meningioma pathogenesis and malignancy〔J〕. Bio Factors,2006;28(3-4):203-19.

6Kim JH,Lee SK,Yoo YC,etalt.Proteome analysis of human cerebrospinal fluid as a diagnostic biomarker in patients with meningioma〔J〕.Med Sci Monit,2012;18(11): BR450-60.

7Yang SY,He XY,Miller D. Hydroxysteroid (17β) dehydrogenase X in human health and disease〔J〕. Mol Cell Endocrinol,2011;343(1-2):1-6.

9Yang SY,He XY,Schulz H. Multiple functions of type 10 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase〔J〕. Trends Endocrinol Metab,2005;16 (4):167-75.

10Smith CM,Bora PS,Bora NS,etal.Genetic and radiation-reduced somatic cell hybrid sublocalization of the human GSTP1 gene〔J〕. Cytogenet Cell Genet,1995;71(3):235-9.

11Rebouche CJ，Engel AG. Tissue distribution of carnitine biosynthetic enzymes in man〔J〕. Biochim Biophys Acta,1980;630(1):22-9.

12Marchitti SA，Brocker C，Stagos D，etal.Non-P450 aldehyde oxidizing enzymes: the aldehyde dehydrogenase superfamily〔J〕. Expert Opin Drug Meta Toxicol，2008；4(6):697-720.

13Crabb DW,Matsumoto M,Chang D,etal.Overview of the role of alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase and their variants in the genesis of alcohol-related pathology〔J〕. Proc Nutr Soc,2004;63(1):49-63.

14Yokoyama A,Muramatsu T,Ohmori T. Alcohol-related cancers and aldehyde dehydrogenase-2 in Japanese alcoholics〔J〕. Carcinogenesis,1998;19(8):1383-7.

15Jin DY,Chae HZ,Rhee SG,etal.Regulatory role for a novel human thioredoxin peroxidase in NF-kappaB activation〔J〕.J Biol Chem,1998;272(49):30952-61.

〔2013-11-10修回〕

(编辑袁左鸣)