反式载脂蛋白A1模拟肽R-D4F对内皮祖细胞黏附及迁移功能的影响

反式载脂蛋白A1模拟肽R-D4F对内皮祖细胞黏附及迁移功能的影响

贺艳红袁晓晨孙京京朱华江姚丹

(扬州大学第二临床医学院心血管内科，江苏扬州225001)

摘要〔〕目的探讨反式载脂蛋白A1模拟肽R-D4F对人内皮祖细胞黏附及迁移功能的影响。方法取新鲜人脐静脉血，采用密度梯法从中分离、诱导培养人内皮祖细胞，并使用Dil-ac-LDL 和FITC-UEA-1 染料进行双荧光染色以及流式细胞术进行鉴定。分别给于牛血清白蛋白、顺式D-4F(50 μg/ml)及R-D4F(5～50 μg/ml)处理后，采用黏附能力测定实验及Transwell 小室观察内皮祖细胞黏附及迁移能力的变化。结果与牛血清白蛋白对照组相比，D-4F显著增强内皮祖细胞的黏附及迁移功能。相似的是，R-D4F呈剂量依赖性地增强内皮祖细胞的黏附与迁移。结论R-D4F具有与D-4F相似的生物学作用，可促进人内皮祖细胞的黏附及迁移。

关键词〔〕载脂蛋白A1模拟肽；R-D4F；内皮祖细胞；黏附；迁移

中图分类号〔〕R543.5〔

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81070096；81270198)；江苏省自然科学基金资助项目(BK2008220,BK2010324)；江苏省第四期科教兴卫工程项目基金(RC2011045)

通讯作者：袁晓晨(1969-)，女，博士，主要从事冠心病基础研究。

第一作者：贺艳红(1988-)，女，硕士，主要从事冠心病基础研究。

Reverse apolipoprotein A-I mimetic peptide-R-D4F promotes the adhesion and migration of human endothelial progenitor cells

HE Yan-Hong,YUAN Xiao-Chen,SUN Jing-Jing,etal.

Department of Cardiovascular Medicine,the Second Clinical Medical College,Yangzhou University,Yangzhou 225100,Jiangsu,China

Abstract【】ObjectiveTo test the effects of reverse Apolipoprotein A-1 mimetic peptide(R-D4F) on the adhesion and migration of human endothelial progenitor cells(EPCs).MethodsThe mononuclear cells were isolated from human umbilical cord blood by Ficoll density gradient centrifugation which were induced and cultured with special EGM-2 medium. EPCs were identified by cellular fluorescence staining with Dil-ac-LDL and FITC-UEA-I and flow cytometry. EPCs were treated with vehicle(BSA),D-4F(50 μg/ml) and R-D4F(5～50 μg/ml),respectively. The characteristics of adhesion and migration of EPC were measured by cellular adhesive assay and Transwell chamber.ResultsR-D4F significantly improved the ability in adhesion and migration of EPCs compared with DMEM control. Similarly,R-D4F also enhanced the biological characteristics in a dose-dependent manner.ConclusionsR-D4F has similar biological effects with D-4F on EPCs and promotes cell adhesion and migration.

【Key words】Apolipoprotein A-1 mimetic peptide；Reverse-D4F(R-D4F)；Endothelial progenitor cells(EPCs)；Adhesion；Migration

动脉粥样硬化的发生与循环中内皮祖细胞(EPC)的减少有关〔1〕，外周循环中低EPC水平可作为发生心血管事件的一个独立危险因素〔2〕。EPC可以在缺血应激诱导下通过归巢的形式促进血管新生及再内皮化，在内皮维护及修复中起重要作用〔3，4〕。载脂蛋白A1是介导高密度脂蛋白(HDL)发挥抗动脉粥样硬化作用的关键成分〔5〕。由于纯化天然HDL成本高昂，采用人工合成载脂蛋白A1模拟肽成为抗动脉粥样硬化治疗的一个有效手段。在当前众多人工合成的载脂蛋白A1模拟肽之中，D-4F模拟肽具有多种内皮保护机制，包括作为一种抗氧化剂、介导胆固醇从泡沫细胞流出和直接抗炎作用〔6,7〕，而这些模拟肽的氨基酸在疏水端排列顺序微妙的调整即可显示出明显不同的脂质结合特性和抗炎作用〔8〕。因此，在D-4F基础上，根据其序列特异设计了一种左手性D-4F镜像序列的模拟肽，同时兼具右手性和反转顺序的特征，被学者称之为反式D-4F(R-D4F)。Qin等〔9〕研究显示，给予apoE缺乏鼠新型模拟肽R-D4F治疗可以明显抑制动脉粥样硬化的发生，可能与其抗氧化、抗炎症和保护血管内皮功能有关〔9〕。本课题组新近报道〔10〕，D-4F可显著增强EPCs的生物学特性，这可能是它发挥抗动脉粥样硬化的一个新机制。本研究在此基础上，旨在进一步探讨R-D4F是否也可对EPCs发挥类似D-4F样生物学效应。

1材料与方法

1.1脐带血收集脐带血标本来自我院产科，产妇年龄不拘，足月妊娠，无并发症，术前四项传播性疾病抗体(包括乙肝表面抗原、丙型肝炎病毒、Ⅰ/Ⅱ型人体免疫缺陷病毒、梅毒抗体)检查阴性，采集前均征得产妇同意并签署知情同意书，所有实验方案获得我院医学伦理委员会同意。留取剖宫产产妇新生儿脐带，每例采集脐静脉血40～60 ml,采用肝素稀释抗凝，随后于4 h内完成单核细胞分离。

1.2主要试剂人淋巴细胞分离液购自天津TBD公司；EGM-2培养基购自LONZA公司；FITC标记抗CD34抗体购自Santa Cruz公司；PE标记抗CD133抗体购自Miltenyi Biotec公司；Dil-ac-LDL购自Invitrogen公司；FITC-UEA-1(FITC-Ulex europaeus agglutinin)购自Sigma-Aldrich公司；载脂蛋白A1模拟肽D-4F及R-D4F均购自辉源生物科技(上海)有限公司；DMEM购自Gibco公司；人纤维连接蛋白购自Millipore公司；胰蛋白酶购自BD公司；Transwell购自CORNING公司。

1.3主要方法

1.3.1细胞培养步骤人纤维连接蛋白以2 μg/cm2浓度包被培养皿，37℃培养箱内孵育过夜。脐静脉血和PBS在50 ml离心管内按体积 1∶1对倍稀释、混匀。先向15 ml离心管中加入6 ml人淋巴细胞分离液，然后用无菌吸管吸取同等体积稀释的脐静脉血轻轻铺在淋巴细胞分离液的液面上，尽量保持液面分界清晰。室温下(18℃～25℃)，水平离心(转子半径10 cm)2 500 r/min离心30 min。取出离心管，无菌吸管吸取中间薄层白雾状单个核细胞层。将单个核细胞置于空离心管中，再加4倍量以上PBS混匀，水平离心机1 500 r/min离心10 min，弃去上清液，留取管底沉淀物。重复PBS洗涤一次，洗去混杂的血浆蛋白、血小板和淋巴细胞分离液。收集管底的单个核细胞，以1×106/ml浓度将细胞重悬于EGM-2完全培养基中，然后将其接种到6 cm的培养皿中。将培养皿置于5%CO2、37℃恒温培养箱中静置培养。4 d后首次换液,轻轻吸去未贴壁细胞，加入新鲜EGM-2培养基继续孵育。之后每周换液2次，每天镜下观察内皮细胞集落形成情况。待细胞长到培养板70%～80% 融合时，用0.25%胰酶消化后进行传代培养观察。

1.3.2细胞双荧光染色鉴定〔11〕细胞培养至7 d时，使用Dil-ac-LDL 和FITC-UEA-1 双荧光染色进行EPCs鉴定。37℃下，细胞在含Dil-ac-LDL(2.5 μg/ml) 的培养液中避光孵育4 h，取出用PBS洗涤2次。然后以4%多聚甲醛固定10 min ，PBS漂洗3次后加FITC-UEA-I(10 μg/ml)避光孵育l h。PBS漂洗3次后在倒置荧光显微镜下观察细胞吞噬Dil-ac-LDL及膜内表面结合FITC-UEA-I的能力。

1.3.3流式细胞术检测EPCs培养至7 d时，行CD34和CD133免疫荧光双标记，通过流式细胞仪分析，检测培养的EPCs中CD34和CD133的阳性率。将计数好的3管细胞(每管约2×107个/ml)4℃300 r/min离心10 min，去除上清，100 μl PBS重悬细胞，其中两管分别加入10 μl CD34和CD133抗体，充分混匀，避光孵育10 min，加1 ml PBS冲洗，300 g离心10 min，弃上清，加100 μl PBS重悬细胞后上机检测(按照说明书操作)。

1.3.4细胞黏附能力检测将培养的EPC首先弃去旧培养基，反复用PBS洗涤后，加无血清的DMEM培养液孵育6～8 h。然后将EPC分为BSA对照组、D-4F(50 μg/ml)组、R-D4F(5，10，50 μg/ml)组。按实验分组加入不同药物后，将细胞置于37℃ 培养箱中孵育24 h 。将EPC消化、重悬于完全培养液中，调整细胞浓度为1×105/ml，接种于FN包被的24孔培养板中。每组6孔，每孔500 μl。各组随机3孔37℃孵育2 h，另外3孔37℃孵育4 h。吸去未黏附的细胞，用PBS轻轻洗涤1次后，显微镜下每孔随机选择8个视野计数，取均数。

1.3.5细胞迁移功能检测用24孔Transwell (孔径8 μm )行体外迁移实验〔12〕。将培养的EPC首先弃去旧培养基，反复用PBS洗涤后加无血清的DMEM培养基孵育6～8 h。用0.25%胰酶消化EPCs、重悬于完全培养基中，调整细胞悬液浓度为1×105/ml。Transwell下室先加600 μl EGM-2培养基，再根据分组加入不同的干预药物。上室中加细胞悬液100 μl。将24孔板置于37℃培养箱中孵育12 h。在另外孔中加4%多聚甲醛，将上室转移到其中，细胞固定15 min。将上室转移到已经加PBS的孔中，用湿棉签擦去上室附着细胞，反复擦3次后用PBS浸洗3次。伊红染色1 min，PBS洗涤后，随机选择10个连续显微镜视野(200倍)计数迁移到上室膜下的细胞，取均数。

2结果

2.1EPC鉴定4 d后首次换液，轻轻吸弃未贴壁细胞。1 w左右即可见到贴壁细胞团簇，细胞呈长椭圆形。部分细胞伸出伪足，向类圆形和不规则形态转变。随着培养时间的延长，细胞逐渐伸长，呈细长条状分布。取此时细胞进行Dil-ac-LDL 和FITC-UEA-1 双荧光染色鉴定，结果证实EPCs均可特异性摄取两种染料(见图1A)。继续观察细胞生长情况，观察到1 w后细胞生长明显加速，呈克隆样生长，逐渐出现大面积团簇状生长，细胞呈放射条索状排列。20 d 左右细胞已基本长满瓶底80%～90%，呈铺路石样改变，形态上符合典型的内皮细胞，而且传代培养后仍保持典型的完整内皮细胞形态特征，见图1B。采用流失细胞术检测细胞表面CD34及CD133的表达情况，显示了分离的细胞具有EPC高表达这些分子的生物学特征(见图2)。

图1　EPCs荧光染色鉴定及后期形态特征(×100)

2.2R-D4F处理可增强EPCs的黏附功能与对照BSA相比较，50 μg/ml D-4F孵育过的EPCs贴服在FN包被培养皿上2 h及4 h的细胞数量明显增多(P<0.05)。以此作为阳性对照，5 μg/ml R-D4F处理即可显著增加贴附在FN培养皿上2 h及4 h EPCs数量(P<0.05)，但作用弱于50 μg/ml D-4F处理组，而50 μg/ml可进一步增强EPCs的贴附，且与D-4F组比较无显著差异，见图3。

2.3R-D4F促进EPC迁移功能与BSA对照相比，50 μg/ml的D-4F处理可显著增强FPC的迁移功能(P<0.05)。相似的是，R-D4F(5～50 μg/ml) 处理可呈剂量依赖性增强FPC的迁移功能(P<0.05)。且与D-4F组相比，50 μg/ml R-D4F作用强度与同剂量的D-4F作用相当，两者间比较无统计学意义，见图4。

图2　EPCs流式鉴定

与对照组比较：1)P<0.05；与D-4F组比较：2)P<0.05；下图同 图3　R-D4F对EPCs贴附能力的影响

图4　R-D4F促进EPCs迁移

3讨论

大量的研究提示，EPCs对血管损伤和高脂血症引起的动脉粥样硬化有保护作用〔1〕。正常人外周血中EPC比例较低，其数量约占单个核细胞的0.002%。但有研究显示，脐带血中EPC数量相对较多，约为外周血中的10倍。此外，由于EPC在动员过程中需要依赖多种生长因子与细胞外基质的支持〔13〕，因此我们预先在培养板中包被足量纤维蛋白，提供有赖于细胞黏附和分化的基质环境，同时应用富含多种内皮生长因子的培养基，结果我们观察到，直接采用脐带血分离EPC，结合密度梯度离心法可得到与先前报道相近纯度的EPCs〔14〕。

研究表明，D-4F可通过多种机制发挥内皮保护效应，如抗氧化、介导胆固醇的逆转运、直接的抗炎作用等。Xie等〔15〕用D-4F干预RAW264.7巨噬细胞，发现D-4F可促进巨噬细胞胆固醇的流出，其机制可能与cAMP-PKA-ABCA1通路有关。Arsell等〔16〕分别对转基因低密度脂蛋白缺乏小鼠(LDL R-/-)、载脂蛋白E受体缺乏小鼠(载脂蛋白E R-/-)注射和口服模拟肽D-4F，结果表明，D-4F能降低血管粥样硬化斑块损害，降低单核细胞趋化作用，增强HDL保护能力。在猴的动物模型上联合使用D-4F和普伐他汀，也可使HDL具有抗炎特性，提高HDL清除胆固醇的能力〔17〕。而反式载脂蛋白A1模拟肽R-D4F作为左手性D-4F镜像序列的模拟肽，因为它同时兼具右手性和反转顺序的特征，可能会有助于通过移除LDL上的磷脂接种分子而改变LDL的脂质参数，使LDL分子更能对抗被氧化修饰；此外，体外研究也显示它比D-4F更能有效抑制脂质过氧化作用〔18〕。 一项临床前期动物研究也表明，R-D4F能有效抑制载脂蛋白E敲除小鼠主动脉根部动脉粥样硬化病变区域的巨噬细胞积聚〔19〕。本课题组新近在小鼠颈动脉结扎模型的研究中也观察到，采用腹腔注射R-D4F同样也可有效抑制血管损伤后血管外膜区域内炎症细胞的浸润，降低局部炎症介质的表达而显著抑制后期血管新生内膜的形成〔18〕。本研究采用D-4F作为阳性对照，与近来报道〔10〕相似的是，R-D4F处理对EPCs也可发挥类似D-4F样效应，显著促进EPCs的黏附及迁移，这可能有助于其发挥促进内皮修复、血管保护效应。

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〔2013-12-09修回〕

(编辑徐杰)