衰老大鼠心肌线粒体PT孔开放对线粒体呼吸功能的影响

衰老大鼠心肌线粒体PT孔开放对线粒体呼吸功能的影响

赵淑琴孙蒙1陈慧颖1张世忠1

(三峡大学校医院，湖北宜昌443002)

摘要〔〕目的研究衰老大鼠心肌线粒体通透性转换(PT)孔开放对线粒体呼吸功能的影响及机制。方法左心室插管检测大鼠心功能；透射电镜检测大鼠心肌组织线粒体形态学改变；线粒体肿胀法检测心肌线粒体PT孔开放程度；氧电极法检测大鼠线粒体呼吸速率；荧光法检测线粒体膜电位。结果同3月龄组大鼠相比，15和18月龄组大鼠线粒体出现空泡肿胀、线粒体内膜脊出现断裂；大鼠左室收缩压(LVSP)和左室压上升/下降最大速率(±dp/dtmax)降低(P<0.01)；线粒体PT孔开放幅度明显增强(P<0.01)，左室舒张末压(LVEDP)升高(P<0.01)；线粒体膜电位下降(P<0.01)；线粒体呼吸速率明显降低(P<0.01)。线粒体PT孔开放抑制了线粒体呼吸功能，降低了线粒体膜电位(P<0.01)，但是抑制线粒体呼吸功能对线粒体PT孔开放和线粒体膜电位无影响(P>0.05)。结论衰老大鼠线粒体PT孔开放可能通过降低线粒体膜电位抑制线粒体呼吸功能。

关键词〔〕心衰；线粒体PT孔；线粒体；呼吸功能

中图分类号〔〕R33〔

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30872716)

通讯作者：张世忠(1970-)，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事心衰机制研究。

doi2Halestrap AP,Pass P.The role of the mitochondrial permeability transition pore in heart disease〔J〕.Biochim Biophys Acta,2009;1787(13):1402-15.

Effect of mitochondrial PT pore on mitochondrial respiratory ratio in aged rats

ZHAO Shu-Qin, SUN Meng,CHEN Hui-Ying,etal.

Medical Science College of China Three Gorges University, Yichang 443002, Hubei, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate effect of mitochondrial permeability transition (PT)pore opening on mitochondrial respiratory function in aged rats.MethodsCardiac function was measured by inserting a tube into the left ventricle of rats. Morphological changes of hearts from rats were detected by transmission electron microscope. Mitochondrial permeability transition pore opening was measured by mitochondrial swelling method. Mitochondrial respiratory function was measured by oxygen electrode method. Mitochondrial membrane potential was measured by fluorescence method.ResultsCompared with rats aged 3 months, the mitochondria in rats aged 15, 18 months was swollen, vacuolated and the mitochondrial ridge was broken; the LVSP and ±dp/dtmax were decreased(P<0.01)，LVEDP was increased (P<0.01) and mitochondrial membrane potential was decreased(P<0.01)；the opening of mitochondrial permeability transition pore was inhibited the respiratiory function of mitochondria and the mitochondrial membrane potential, respectively(P<0.01).However,inhibition of mitochondrial respiratory function had no effect on opening of mitochondrial permeability transition pore and the mitochondrial membrane potential(P>0.05).ConclusionsOpening of mitochondrial permeability transition pore could inhibit mitochondrial respiratory function via decreasing mitochondrial membrane potential.

【Key words】Heart failure; Mitochondrial permeability transition pore; Mitochondria;Respiratory function

1三峡大学医学院

第一作者：赵淑琴(1969-)，女，主管护师，主要从事心衰护理研究。

线粒体通透性转换(PT)孔是位于线粒体内膜上的非特异性孔道〔1〕，在心肌细胞凋亡、心肌缺血/再灌注损伤中具有重要的作用〔2〕。笔者以往的研究表明，随年龄增长，线粒体PT孔开放呈增强趋势，并伴随心功能减退和心肌细胞的大量凋亡〔3，4〕。本研究在此基础上进一步研究了线粒体PT孔开放与线粒体呼吸功能的关系，并对其机制进行探讨。

1材料与方法

1.1.材料

1.1.1主要试剂鱼藤酮、ADP、羧基苍术苷、环孢菌素A、罗丹明123均购自sigma公司，马斯亮蓝蛋白定量检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，BSA购自Roche公司，EGTA和Tris-HCl购自Ameresco公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2主要仪器及装置高速冷冻离心机(Suprafuge 22，德国)；紫外可见光分光光度计(UV-2100型,尤尼柯仪器公司)；氧电极(Oxytherm,汉莎科学仪器有限公司)；多功能显微镜及图像分析系统；透射电镜(H-7500，日本)

1.2方法

1.2.1心肌组织形态学电镜检测不同月龄(3、15、18月龄)SD大鼠取左心室前侧心肌组织块切成1 mm×1 mm×1 mm大小，先后经2.5%戊二醛和0.1%饿酸双重固定后，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，然后经乙醇-丙酮梯度脱水，环氧树脂渗透、包埋，半薄切片、超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色后日立H-600透射电镜观察心肌超微结构变化。

1.2.2在体大鼠心功能检测各组大鼠以4%水合氯醛(0.4 g/kg)腹腔注射麻醉，在颈部作正中切口，暴露气管，气管插管并接呼吸机。分离大鼠左侧颈总动脉，将导管经左侧颈总动脉插入左心室，导管另一端与血压传感器相连，通过biopac16道生理信号采集处理系统记录左室收缩曲线，检测左心室收缩压(LVSP)、左室压上升和下降最大速率(±dp/dtmax)，左心室舒张末压(LVEDP)。

1.2.3心肌线粒体分离提取心室称重后在冰冷的匀浆液(160 mmol/L KCl，10 mmol/L EGTA，0.5%小牛血清BSA，pH 7.4)中剪碎，匀浆机匀浆，然后按1∶10的体积用匀浆液稀释后用低温离心机在2℃ 1 000×g下离心10 min，取上清液在2℃离心10 min，弃去上清，底部沉淀即为初步提取的线粒体。用重悬液(320 mmol/L sucrose，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4)将初提的线粒体进行重悬，然后再次在2 ℃离心10 min，得到较为纯净的线粒体。

1.2.4线粒体PT孔开放测定对分离的线粒体蛋白定量并用肿胀液(120 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L MOPS，5 mmol/L KH×2PO×4，pH 7.4)将线粒体蛋白浓度稀释为0.25 mg/ml，然后加入Ca2+(200 μmol/L)至2 ml线粒体中，诱发线粒体通透性转换孔开放，同时用全波长酶标仪每10 s监测1次，连续监测15 min线粒体在520 nm处的吸光度变化。

1.2.5线粒体呼吸功能检测方法用氧电极法对线粒体呼吸功能进行测量。将氧电极定标，在反应杯中加入1.5 ml反应介质(mmol/L，蔗糖 250，Tris 10，EGTA 10，磷酸二氢钾 10，pH 7.4)和0.5 ml线粒体(0.5 mg/ml)悬液，待溶氧曲线斜率稳定，此时所得曲线为Ⅰ态呼吸曲线；加入琥珀酸钠(终浓度10 mmol/L)，待溶氧曲线斜率稳定，此时所得曲线为Ⅱ态呼吸曲线；加入ADP(终浓度0.05 mmol/L)，待溶氧曲线稳定，此时所得曲线为Ⅲ态呼吸曲线；待ADP消耗后，曲线斜率大幅下降，此时所得曲线为Ⅳ态呼吸曲线。使用Oxygraph软件测量斜率，选取每个呼吸状态曲线中间平直的部分测量斜率，以减小误差。以RCR表示线粒体呼吸功能强弱并通过以下公式进行计算：RCR=ST3斜率/ST4斜率。

1.2.6心肌线粒体膜点位测定用酶解法分离心肌细胞，进行细胞计数，使用孵育液将细胞稀释至1×105个/ml，添加20 nmol/L的罗丹明123，37℃避光孵育30 min，1 000 r/min离心后，用孵育液冲洗3次，使用荧光显微镜绿色镜片进行拍照分析。

2结果

2.1各组大鼠心肌组织形态学变化电镜检测结果在透射电镜下观察各组大鼠心肌线粒体形态，可见3月龄组线粒体内外膜结构完整，嵴完整无断裂，线粒体排列整齐致密。15和18月龄组线粒体形态不规则，内膜断裂，脊不完整，部分线粒体可见明显空泡，甚至出现破裂，见图1。

图1　不同月龄大鼠心肌组织电镜图(× 40 000)

2.2各组大鼠心功能改变与3月龄组大鼠相比，15和18月龄组LVSP(A)、±dp/dtmax(B、C)均明显下降(P< 0.01)，LVEDP(D)均明显增高(P< 0.01)。见表1。

2.3各组大鼠线粒体PT孔开放、线粒体呼吸速率、膜电位改变与3月龄大鼠相比，15、18月龄大鼠线粒体PT孔开放速率明显增大(P< 0.01)，线粒体呼吸速率明显降低(P<0.01)大鼠心肌细胞荧光强度明显减小(P< 0.01)，表明膜电位明显降低。见表2。

表1　各月龄大鼠心脏LVSP(A)、±dp/dtmax(B、C)、

与3月龄比较：1)P<0.01

表2　各月龄大鼠心肌线粒体PT孔开、

2.4抑制线粒体呼吸作用对线粒体PT孔开放的影响在3月龄大鼠，用线粒体呼吸链第一链呼吸抑制剂ROT(50 μmol/L)和第二链抑制剂Carboxine(200 μmol/L)分别抑制线粒体呼吸功能，未能引起线粒体PT的开放，3、15、18月龄组A520下降百分率分别为(0.12±0.004)%、(0.11±0.016)%、(0.10±0.018)%(P> 0.05)。

2.5线粒体PT孔开放对呼吸功能、线粒体膜电位的影响在分离的3月龄大鼠心肌细胞线粒体，用线粒体PT孔开放剂Atr(2 μmol/L)开放PT孔，明显减小了线粒体呼吸速率对照组、Atr组氧耗分别为(15.8±0.5)、(4.85±0.1)mmol·min-1·mg-1(P< 0.01)，3、15、18月龄心肌荧光强度分别为0.39±0.03、0.24±0.01、0.20±0.02(P< 0.01)，表明线粒体膜电位明显降低。

2.6抑制线粒体呼吸作用对线粒体膜电位的影响在3月龄大鼠，用线粒体呼吸链第一链呼吸抑制剂ROT(50 μmol/L)和第二链抑制剂Carboxine(200 μmol/L)分别抑制线粒体呼吸功能，未能引起线粒体膜电位改变，对照组、ROT组和Carboxine组膜电位荧光强度分别为0.39±0.02、0.34±0.03、0.37±0.02(P> 0.05)。

3讨论

线粒体PT孔是位于线粒体内膜的非特异性孔道，其开放可诱发线粒体肿胀、细胞色素c的释放、细胞凋亡，在心肌缺血/再管注损伤中发挥重要的作用〔5〕。

研究〔3,4〕表明，随年龄增长线粒体PT孔开放明显增强。本研究中，第1次对比了3月龄和15、18月龄大鼠线粒体PT孔开放情况，结果同以往已发表的观察结果趋势一致。为了进一步检测15、18月龄大鼠心功能是否出现衰退，结果显示，15、18月龄组大鼠心肌组织线粒体出现明显形态学变化，表现为线粒体肿胀、线粒体内膜损坏、脊断裂。这些研究结果表明，15、18月龄大鼠心功能出现明显衰退。

心肌线粒体的主要功能是为心肌的收缩和舒张活动提供所需能量，这主要是由线粒体的呼吸功能完成的。因此，笔者推测，随年龄增长，线粒体PT孔开放增强可能通过影响线粒体呼吸功能而造成心功能衰退。笔者对心功能出现衰退的15、18月龄大鼠线粒体呼吸功能进行了检测，结果间接证明了上述推测的可能性，但并不能说明该两组大鼠线粒体呼吸功能的减退的确是由线粒体PT孔开放增强所致。为此，笔者在分离的3月龄大鼠线粒体上进一步进行了实验，结果诱发线粒体呼吸功能明显减退，相反，实验中如果用线粒体呼吸链抑制剂ROT和Carboxine抑制线粒体呼吸功能，结果并未诱发线粒体PT孔开放发生改变。这些实验结果表明，线粒体PT孔随年龄增长出现开放增强的趋势，且PT孔开放可抑制线粒体呼吸功能。

线粒体膜电位与线粒体呼吸功能有密切联系〔6〕，为了进一步探讨线粒体PT孔开放抑制线粒体呼吸功能的机制，笔者对线粒体膜电位进行了检测。结果表明线粒体膜电位减小可能参与了PT孔开放诱发的线粒体呼吸抑制。为进一步证实此推测，笔者在3月龄大鼠心肌线粒体上用线粒体PT孔开放剂Atr开放线粒体PT孔，结果表明，线粒体膜电位降低参与了PT孔开放增强引起的线粒体呼吸功能减退。

综上，随年龄增长，线粒体PT孔开放可能通过降低线粒体膜电位抑制线粒体呼吸功能，从而造成心功能减退。

4参考文献

1Bernardi P,Forte M.The mitochondrial permeability transition pore〔J〕.Novartis Found Symp,2007;287(1):157-64.

3赵淑琴，王秀静，张世忠，等.随年龄增长心肌线粒体PT孔开放改变及其机制〔J〕.中国应用生理学杂志，2011；27(2):143-62.

4王秀静，赵淑琴，张世忠，等.线粒体PT孔在心功能自然衰退过程中的作用〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(8):787-90.

5Forte M,Bernardi P.The permeability transition and BCL-2 family proteins in apoptosis:co-conspirators or independent agents〔J〕.Cell Death Differ,2006;13(11):1287-90.

6Magnani ND,Marchini T,Vanasco V,etal.Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase and mitochondrial dysfunction in lung after an acute exposure to residual oil fly ashes〔J〕.Toxicol Appl Pharmacol,2013;270(1):31-8.

〔2013-05-13修回〕

(编辑曲莉)