PCI术后患者CYP2C19基因多态性与氯吡格雷抵抗关联性研究

彭文星，徐晓宇，石秀锦，林 阳

（1.首都医科大学化学生物学与药学院临床药学系，北京 100069；2.首都医科大学附属北京安贞医院药事部，北京 100029）

·临床评价·

PCI术后患者CYP2C19基因多态性与氯吡格雷抵抗关联性研究

彭文星1,2，徐晓宇1,2，石秀锦2，林 阳2

（1.首都医科大学化学生物学与药学院临床药学系，北京 100069；2.首都医科大学附属北京安贞医院药事部，北京 100029）

目的：探讨PCI术后患者CYP2C19基因多态性与氯吡格雷抵抗的关联性。方法：回顾性筛选2006年3月 – 2015年4月444例诊断为急性冠脉综合征（ACS）并进行PCI治疗的患者，以ADP诱导的血小板聚集率＞ 46%定义为氯吡格雷抵抗，血小板聚集率≤46%定义为氯吡格雷敏感，分析两组之间基因型的差异，并比较不同基因型发生氯吡格雷抵抗的危险度。结果：CYP2C19*2、*3突变杂合子的氯吡格雷抵抗风险显著高于野生型*1/*1。两组患者中CYP2C19*2/*2、*2/*3发生氯吡格雷抵抗的风险更高。相对于*1/*1基因型，*1/*2、*2/*2和*2/*3具有更高的血小板聚集率。结论：急性冠脉综合征患者CYP2C19*2、*3突变与氯吡格雷抵抗相关，随着CYP2C19*2、*3的突变基因位点数量增加血小板聚集率也逐渐增加。

氯吡格雷；基因多态性；CYP2C19；急性冠脉综合征

急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）是危害中国人群健康的一种常见疾病。冠状动脉介入术（percutaneous coronary intervention，PCI）是治疗ACS的方法之一。阿司匹林和氯吡格雷双抗治疗已成为PCI术后预防支架血栓、脑中风等缺血性心脑血管事件的常规方案。由于个体差异，约4% ～30%的患者服用常规剂量的氯吡格雷达不到预期的抗血小板疗效[1]。氯吡格雷是一种前体药物，需经过两步代谢生成活性代谢产物，其中细胞色素P450（CYP）2C19参与了氯吡格雷的两次代谢[2]。最近相关研究发现编码CYP2C19酶的基因位点多态性与氯吡格雷抵抗有关，若该位点突变为失功能等位基因可使氯吡格雷的疗效降低，并增加患者心血管事件的发生率[3-6]。本研究分析CYP2C19基因突变与氯吡格雷抵抗的相关性，进一步探索氯吡格雷抵抗的遗传因素，为临床制定合理的抗血小板方案提供理论依据。

1 方法

1.1 研究人群

回顾性收集2006年3月 – 2015年4月入院并进行基因检测的3078例患者，最终共筛选出444例患者。纳入标准：服用标准剂量阿司匹林100 mg·d-1和氯吡格雷75 mg·d-1抗血小板治疗，持续至少3 d，用药3 d后进行血小板聚集率检查，已完成CYP2C19*2和*3基因检测。排除标准：慢性肝病病史，严重肾功能不全（Cr ＜ 30 mL·min-1），合并出血性疾病，有阿司匹林或氯吡格雷的禁忌证，只使用单抗治疗，血小板计数小于100×109·L-1，合并使用华法林，同时使用西洛他唑或替格瑞洛等新型抗血小板药物。

1.2 血小板聚集率

用枸橼酸抗凝管采血3 ～ 5 mL，用比浊法进行血小板功能检测，先将试管在4000 ～ 5000 r·min-1离心5 min，得到富含血小板的血浆（PRP），再于22 500 r·min-1高速离心15 min获得含少量血小板的血浆（PPP），将PPP加入PRP中，将血小板浓度稀释至2×105·μL-1，加入6 μmol·L-1的ADP诱导血小板聚集，之后测定血小板聚集率，仪器采用Chrono-Log Lume-Aggregometer（model 700，美国）。

1.3 基因位点测定

用EDTA（乙二胺四乙酸）抗凝管采血2 ～ 3 mL，采用荧光染色原位杂交检测法。取150 μL血加入1 mL红细胞裂解液，静置5 min后，在3000 r·min-1离心5 min，弃上清，再加入核酸纯化试剂（北京华夏时代基因科技发展有限公司），混匀后加入相应的测序反应通用试剂（北京华夏时代基因科技发展有限公司），采用双通道实时荧光定量PCR仪（TL988A，西安天隆科技有限公司）进行检测。

1.4 氯吡格雷抵抗定义

我们将ADP诱导的血小板聚集率＞ 46%定义为氯吡格雷抵抗，以ADP诱导的血小板聚集率≤46%定义为氯吡格雷敏感。这个临界点的选择来自于之前的研究结果，ADP诱导的血小板聚集率＞ 46%的患者两年内缺血性心血管事件的发生率显著大于对照组[7]。有研究将血小板聚集率＞ 70%（ADP为20 μmol·L-1）定义为抵抗，也有研究将血小板聚集率最高的25%人群定义为抵抗[8-10]。从临床实用性和本研究的实验方法考虑，我们将临界点设定为46%。

1.5 统计学分析

采用SPSS17.0对数据进行统计学分析。正态性连续性变量采用（均值±标准差）表示，非正态性资料采用中位数和四分位数表示，计数资料用百分比表示。正态性连续性变量采用双侧t检验比较两组之间的差异，计量资料采用卡方检验或者Fisher精确检验。基因型的比较采用单因素ANOVA分析，两组之间基因型或者位点的比较采用卡方检验，以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究人群的基线水平

根据纳入排除标准，最终共纳入444例诊断为ACS并行PCI的患者，依据ADP诱导的血小板聚集率分组，氯吡格雷抵抗组共254例（57.2%），敏感组共190例（42.8%）。444例患者的平均年龄为（59.39 ±9.77）岁（范围32 ～ 83岁）。其中肌酐、尿酸、空腹血糖、甘油三酯、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、白细胞、血小板结果不符合正态分布，采用中位数和四分位数来表示离散程度。结果显示两组人群一般情况均无显著性差异，表明患者的年龄、支架数量与长度、病变血管数量与合并用药等均不是引起氯吡格雷抵抗的危险因素，详见表1。所有患者ADP诱导的血小板聚集率为（48.85±17.52）%，且符合正态性分布。

2.2 CYP2C19*2、*3的基因分布与氯吡格雷抵抗的关联性

分别分析两组间CYP2C19*2、*3的每种基因类型分布，详见表2。氯吡格雷突变杂合子*1/*2和*1/*3发生抵抗的危险度分别是*1/*1的2.15倍[95%CI（1.39，3.33），P = 0.001]和2.24倍[95%CI（1.01，4.94），P = 0.043]，而突变纯合子*2/*2和*2/*3发生氯吡格雷抵抗的危险度分别高达4.89倍[95%CI（2.44，9.81），P ＜ 0.001]和6.12倍[95%CI（1.68，22.38），P = 0.002]。所有患者中只有3例为*3/*3纯合子，均为抵抗组，由于病例较少，尚不能得出统计学差异和相对危险度。

2.3 不同基因型对应的ADP诱导的血小板聚集率

不同基因型ADP诱导的血小板聚集率的差异见表3。CYP2C19*1/*2突变杂合子的血小板聚集率显著高于*1/*1（P ＜ 0.001），而CYP2C19*1/*3与野生型*1/*1相比没有表现出显著性差异（P = 0.055）。而突变纯合子（*2/*2、*2/*3和*3/*3）与野生型*1/*1相比均具有显著性差异，且突变位点数目越多，对应的血小板聚集率越高。

3 讨论

3.1 结果分析

氯吡格雷抵抗是有多种因素复合造成的，现已知的因素有基因多态性（CYP2C19、PON1、ABCB1等）、用药依从性、饮食、吸烟以及药物相互作用等，基因多态性是其中十分重要且研究较多的危险因素[11]。本研究根据ADP诱导血小板聚集率分为氯吡格雷抵抗组和敏感组。两组患者的基线水平没有显著性差异。

本研究结果显示CYP2C19单位点突变*1/*2和*1/*3相对于野生型*1/*1显著增加了氯吡格雷抵抗的风险，两位点同时突变*2/*2和*2/*3基因型氯吡格雷抵抗的风险度更大，见表2。原因是当CYP2C19突变时，人体代谢氯吡格雷的酶活性降低，进而代谢活性产物降低，无法达到预期的临床疗效，随着突变位点的增加，酶的活性就越低。中国人群中该基因的突变频率（约40%）高于非洲人和高加索人（突变率13%）[12]，故应更加重视该基因的突变。本研究不能证明CYP2C19基因突变增加ACS患者的心血管事件发生率，但不同CYP2C19基因型的血小板聚集率有显著差异，说明基因检测与血小板功能检测有很好的一致性。

表1 研究人群的基线信息Tab 1 Baseline characteristics of the study population

本研究发现以野生型*1/*1为基础，突变为*1/*2时血小板聚集率明显增加（41.88±17.05 vs 51.17±16.05）。既往研究显示随着血小板聚集率的增加，发生缺血性心血管事件的风险增加，故该位点突变是氯吡格雷抵抗的重要原因之一[13-14]。*1/*3基因型相比于*1/*1的血小板聚集率有所增加，但是增加程度尚不具有显著性差异（48.52±17.05 vs 41.88±17.05，P = 0.055），原因是中国人群中*3位点突变频率较低，该研究中*1/*3的病例数共31例，病例数较少，该结果仍需要大规模的研究加以验证。

表2 基因型分布与氯吡格雷抵抗的关联性Tab 2 The correlation between genotype distribution and clopidogrel resistance

表3 CYP2C19*2、*3与血小板聚集率的关联性Tab 3 The correlation between CYP2C19*2, *3 and platelet aggregation rate

3.2 实验方法

本研究采用比浊法进行血小板功能检测，与先前的研究采用了相似的检测方法。血小板聚集试验是一种体外的血小板功能检测，虽然该方法有一定限制性，如重复性较差和繁琐的制作样本流程，但仍是最常用的血小板功能检验的方法之一。有研究显示根据血小板功能检测调整给药方案不能改善患者的预后，但这些研究主要入选者为非ACS患者，这类患者主要心血管事件（MACE）风险本身就较低。如TRIGGER-PCI研究仅纳入择期手术的稳定期患者，236例患者中主要终点事件仅有1例[15]。

3.3 相关研究与分析

部分研究没有得到CYP2C19*2、*3突变基因与MACE发生率的相关性，主要是因为这些研究并没有严格入选接受PCI的患者，而大多数临床研究，包括meta分析仍证实了CYP2C19*2、*3与氯吡格雷抵抗的显著相关性[16-19]，本研究也进一步证实基因突变对患者的影响。GRAVITAS研究纳入了1028例行PCI的患者，从42个位点中仅筛选出CYP2C19*2与血小板高反应性密切相关，与本研究不同之处是该研究采用VerifyNow进行血小板功能检测，检测时间点为术后12 ～ 24 h、30 d以及6个月，研究中由于CYP2C19*3突变频率较低，该位点没有得出阳性结论[20]。一项来自中国人群的研究纳入了447例PCI术后且进行双抗治疗的患者，在氯吡格雷相关14个基因位点中仅发现CYP2C19*2、*3位点与血小板功能具有显著相关性，但没有比较二者的联合作用[21]。本研究则联合考虑了CYP2C19*2、*3位点，并进行综合分析，结果显示CYP2C19*2、*3突变均与氯吡格雷抵抗相关。相关研究如ARMYDA-PRO研究证实了血小板高反应性与不良心血管事件的关联性，血小板高反应性的患者30 d心血管事件发生率是对照组的6倍（OR = 6.1；P = 0.033）[22]。Parodi等[23]研究发现在短期和长期随访中PCI术后患者血小板高反应性与缺血事件显著相关（HR = 1.49；P = 0.02）。本研究显示CYP2C19与血小板高反应有明显的相关性，提示在CYP2C19突变的人群中发生心血管事件的风险增加。相关研究如Fast-MI研究和ADAPT-DES研究也得出了相似的结论：对于ACS，特别是接受PCI治疗的患者中，携带CYP2C19突变基因的患者发生心血管事件的风险显著增加[24-25]。

3.4 局限性

本研究并未获得患者的预后信息，仅根据血小板聚集率指标反映药物疗效，未获得药物的临床反应性。其次，采用比浊法检测血小板功能不能获得良好的重现性，导致结果可能有所偏差。本研究为回顾性分析，每个患者进行血小板功能检测的时间不完全相同，可能造成实验室检测结果的差异。此外，本研究中CYP2C19*3/*3基因型仅有3例，由于例数较少，且3例均为抵抗组，故没有得到显著性差异，无法进行危险度分析。

4 小结

本研究揭示了单位点基因检测是预测患者对血小板反应性的方法之一，在患者进行PCI治疗之前进行基因型检测，可根据患者的基因型选择适合的治疗方案，避免因药物未起效而发生急性心血管事件，如支架血栓、急性心梗等[26]。且单位点基因检测相对于其他检测方法，用时较短，检测方便，可及时为临床提供准确的药物基因信息，并可预测患者的氯吡格雷抵抗风险，为患者选择合适的抗血小板药物提供参考依据。

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Correlation study between CYP2C19 gene polymorphisms and clopidogrel resistance in PCI postoperative patients

PENG Wen-xing1,2, XU Xiao-yu1,2, SHI Xiu-jin2, LIN Yang2
(1. Clinical Pharmacology, School of Chemical Biology and Pharmaceutical Science, Capital Medical University, Beijing 100069, China; 2. Department of Pharmacy, Beijing Anzhen Hospital, Beijing 100029, China)

Objective:To explore the relationship between clopidogrel resistance and CYP2C19 gene polymorphisms.Methods:A total of 444 cases diagnosed as acute coronary syndrome (ACS) and treated with PCI were retrospectively selected from March 2006 to April 2015. The platelet aggregation rate induced by ADP more than 46% was defined as the clopidogrel resistance, and platelet aggregation rate of 46% or less was defined as sensitive to clopidogrel. Comparison of genotype differences between two groups and risk of clopidogrel resistance among different genotypes were analyzed.Results:CYP2C19*2 or *3 heterozygote mutations in ACS patients were associated with a significant increase the risk of clopidogrel resistance compared with CYP2C19*1/*1. CYP2C19*2/*2 and *2/*3 were at higher risk of clopidogrel resistance. Platelet aggregation rates of *1/*2、*2/*2 and *2/*3 were significantly higher than that of *1/*1 genotype.Conclusion:CYP2C19*2 or *3 mutations were associated with clopidogrel resistance in ACS patients. The rate of platelet aggregation increased with the increase of the number of mutant gene loci of CYP2C19*2 and *3.

Clopidogrel; Gene polymorphism; CYP2C19; Acute coronary syndrome

R972

A

1672 – 8157(2015)06 – 0334 – 05

2015-08-01

2015-09-30）

“重大新药创制”科技重大专项课题 （2012ZX09303016-016）

林阳，女，主任药师，主要从事医院药事管理和药物临床研究工作。E-mail：linyang3623@163.com

彭文星，女，在读硕士研究生，主要从事临床药物治疗和个体化用药工作。E-mail：shouyipwx@163.com