用超高效液相色谱蒸发光散射检测桔梗流浸膏指纹图谱的研究

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用超高效液相色谱蒸发光散射检测桔梗流浸膏指纹图谱的研究

笔雪艳1，胡畔2，张胜波3，张清波1(1. 黑龙江省食品药品检验检测所，黑龙江 哈尔滨 150001； 2.鞍山市药品检验所，辽宁 鞍山 114000； 3.济宁市药品检验所，山东 济宁 272025)

[摘要]目的 建立桔梗流浸膏的指纹图谱检测方法，以达到质量的均一和稳定。方法采用UPLC-ELSD法，乙腈-水梯度洗脱，色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，柱温：30 ℃，流速：0.2 ml/min，在20 min内，得到11个分离度良好的色谱峰。结果 采用中药色谱指纹图谱相似度软件计算，桔梗流浸膏样品相似度均大于0.90，符合指纹图谱要求。结论 该方法经稳定性、重复性、精密度考察，是一种快速、准确的中药质量评价方法。

[关键词]桔梗；流浸膏；超高效液相色谱；蒸发光散射检测；指纹图谱

[基金项目]国家药品标准提高暨2015版药典科研项目(TS-P021)

[作者简介]笔雪艳，硕士，主任药师.研究方向：中药质量标准研究.E-mail：hljbixueyan@sina.cn

[通讯作者]张清波.E-mail:qingbo9118@sina.com

[中图分类号]R917[文献标志码]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.02.016

[收稿日期]2014-01-04[修回日期]2014-07-18

Research on fingerprint analysis of platycodonis liquid extract by UPLC-ELSD

BI Xueyan1, HU Pan2, ZHANG Shengbo3, ZHANG Qingbo1(1. Heilongjiang Institute for Food and Drug Control, Harbin 150001, China； 2. Anshan Institute for Drug Control, Anshan 114000, China； 3. Jining Institute for Drug Control, Jining 272025, China)

Abstract[]ObjectiveTo develop a stable method for fingerprint analysis of extractum platycodi liquidum to ensure its uniformity and stability.MethodsUPLC-ELSD was applied to obtain a chromatogram with 11 well separated peaks, and the chromatographic condition was as follows: mobile phase was gradient elution by acetonitrile-water, column was ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1×100 mm, 1.7 μm) with the column temperature of 30 ℃ and the flow rate of 0.2 ml/min.ResultsThe chromatographic fingerprints were analyzed with similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM. Similarities were all greater than 0.90, which could meet the requirement for chromatographic fingerprint of TCM.ConclusionThe stability, repeatability and precision of the developed method were all validated, and the chromatographic fingerprint analysis was a rapid and accurate method for the quality evaluation of traditional Chinese medicine.

[Key words]Platycodonis; liquid extract; UPLC; ELSD; fingerprint

桔梗流浸膏作为中成药中投料用的一种原料，其质量标准收载于国家卫生部药品标准中药成方制剂(第11册)[1]。我国现有桔梗流浸膏批准文号的生产企业为5家，以桔梗流浸膏作为处方投料的中成药品种有14个，其中6个品种在制剂中收录的桔梗流浸膏制法与上述标准基本相同。涉及到以桔梗流浸膏投料的中成药厂家有300多家。在这些成方制剂的标准中，均无对桔梗流浸膏的质量控制。而现行标准缺乏专属性的质量控制指标。目前在桔梗的研究中，对其中药材及饮片的研究比较多[2-8]，但对桔梗流浸膏的指纹图谱研究目前还未见报道。本实验应用超高效液相色谱(UPLC)蒸发光散射检测(ELSD)器建立桔梗流浸膏的指纹图谱检查方法，从而对桔梗提取物的质量标准进行有效控制。

1仪器与试药

ACQUITY超高效液相色谱仪：美国Waters公司(配有二元高压梯度泵、自动进样器、低噪音空气泵、柱温箱、蒸发光检测器以及Empower数据处理工作站)；对照品：桔梗皂苷D(批号：111851-201001，中国药品生物制品检定所)；乙腈为色谱纯(美国Burdick&Jackson公司)；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。

桔梗流浸膏样品(10个批次)：实验室自制，药材来源：河北安国、大庆林甸、齐齐哈尔、安徽亳州、湖北、湖北磐山、山东淄博、吉林延吉、陕西、河南。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；柱温：30 ℃；流速：0.2 ml/min，检测器：ELSD；气体压力：40 psi；漂移管温度：80 ℃；雾化器方式：冷却。流动相：乙腈-水梯度洗脱：0～5 min, 20:80； 5～18 min, 24:76；18～20 min, 25:75；进样量：1 μl。

2.2供试品溶液的制备精密量取桔梗流浸膏样品2 ml，置蒸发皿中低温蒸至无醇味，残渣加水2 ml使其溶解，上于D101型大孔吸附树脂柱(内径2 cm，长15 cm)，分别以200 ml水和150 ml 80%乙醇洗脱，收集醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至10 ml量瓶中，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，注入超高效液相色谱仪，测定，即得。

2.3参照物溶液的制备精密称取桔梗皂苷D对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.2 mg桔梗皂苷D的溶液作为参照物溶液。

2.4方法学考察

2.4.1精密度精密吸取同一批桔梗流浸膏样品溶液1 μl，按照上述色谱条件连续进样5次测定，计算11个色谱峰的保留时间及峰面积的相对标准偏差(RSD)。相对保留时间的RSD为0.04%～0.70%，相对峰面积的RSD为0.19%～1.17%，均<2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.2重复性分别取同一批桔梗流浸膏6份，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照所建立的UPLC指纹图谱分析条件进行分析，结果显示，桔梗流浸膏的主要色谱峰相对保留时间的RSD为0.08%～0.48%，相对峰面积的RSD为0.44%～1.44%，均<2.0%，表明方法的重复性良好。

2.4.3稳定性取“2.4.2”项下制备的其中1份桔梗流浸膏供试品溶液于室温放置，分别于0、2、4、8、12、16、20、24 h进样测定，桔梗流浸膏的主要色谱峰相对保留时间的RSD为0.06%～0.22%，相对峰面积的 RSD为0.17%～1.25%，均<2.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5桔梗流浸膏指纹图谱的建立

2.5.1样品的制备采用10批不同产地的桔梗药材按文献[1]中制法制备桔梗流浸膏样品。

2.5.2测定方法取上述10批桔梗流浸膏按“2.2”项下制成供试品溶液，精密吸取1 μl，注入液相色谱仪，按“2.1”项下条件测定，并用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”对其色谱图进行相似度评价，建立桔梗流浸膏的指纹图谱，并计算相似度。色谱图见图1～3。

图1　桔梗皂苷D的超高效液相色谱图

图2　桔梗流浸膏的超高效液相色谱对照指纹图谱

图3　10批桔梗流浸膏超高效液相色谱指纹图谱

2.5.3共有峰的确定为了准确有效地识别指纹图谱，根据桔梗流浸膏指纹图谱中各色谱峰的分离情况确定11个指纹共有峰，即图2中1～11号峰。通过与对照品对照，确认5号峰为桔梗皂苷D。

2.5.4桔梗流浸膏相似度测定结果依照本研究确定的UPLC指纹图谱条件对10批桔梗流浸膏样品进行测定，并导入相似度评价系统进行比较分析。以10批样品的色谱图建立参照图谱，以上述确定的11个共有峰作为校正点，采用中位数法进行相似度的评价分析，详见表2。由相似度计算结果所示，10批桔梗流浸膏样品的相似度均>0.90。

3讨论与分析

3.1检测器的选择由于桔梗中的有效成分为皂苷类，其在紫外区均为末端吸收，在使用紫外低波长检测时，往往会受到溶剂干扰，使结构相似的桔梗皂苷难以得到有效分离。因此采用蒸发光散射检测法。

3.2流动相的选择通过对乙腈(V/V)-水(V/V)、甲醇(V/V)-水(V/V)和乙腈-0.5%甲酸水(V/V)系统的考察，结果表明：应用乙腈(V/V)-水(V/V)系统洗脱，可对桔梗流浸膏样品取得较好的分离。

表2　10批桔梗流浸膏相似度计算结果

3.3色谱柱的选择分别试用了ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色谱柱、ACQUITY UPLC HSS C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色谱柱和ACQUITY UPLC HSS T3 C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色谱柱，采用上述确定的流动相系统，进行桔梗流浸膏样品的UPLC分析。结果表明：应用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色谱柱，可对桔梗流浸膏样品得到较好的分离。

3.4柱温的选择实验考察了30、35、40 ℃ 3个柱温条件，结果表明：柱温30 ℃时指纹图谱基线平稳，各成分分离效果好。

3.5流速的选择本实验设置了0.1、0.2、0.3 ml/min 3个流速。当流速为0.3 ml/min时，随着保留时间的缩短，有些色谱峰即重叠；流速为0.2或0.1 ml/min时，各成分的分离效果较好，本研究选择流速为0.2 ml/min。

桔梗的成分十分复杂，且含有多对同分异构体。因采用HPLC的分析时间较长，故本实验采用UPLC色谱技术，它与传统的HPLC法相比，具有缩短分析时间、增加峰容量、提高灵敏度等优点，因此是一种快速、准确的中药质量评价方法。

【参考文献】

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准[S].第11册.1996：149.

[2]许传莲，郑毅男，杨腊虎，等.HPLC法测定不同采收期及不同部位桔梗中桔梗皂苷D含量[J]. 吉林农业大学学报，2001，23(1)：58-60,64.

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[4]许传莲，杨腊虎，郑毅男，等.应用RP-HPLC法测定不同产地桔梗中桔梗皂苷D[J]. 吉林农业大学学报,1999，21(4)：35-38.

[5]黄樱，史春蕾，刘墨祥，等.HPLC-ELSD法测定桔梗饮片中8种桔梗皂苷的含量[J]. 扬州大学学报(自然科学版)，2008，11(4)：41-44.

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[本文编辑]李睿旻