聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂AG014699提高BRCA2缺陷的胰腺癌细胞放射敏感性的体外实验研究

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂AG014699 提高BRCA2缺陷的胰腺癌细胞放射敏感性的体外实验研究

谢建国钟睿万爱萍汪华康恭礼何志坚钟晓鸣

作者单位:330029 江西省肿瘤医院

【摘要】目的探讨AG014699提高含BRCA2基因缺陷的胰腺癌细胞放射敏感性的作用机制。方法选择Capan-1和Panc-1 2种胰腺癌细胞株，分成单纯药物组、单纯放疗组、药物联合放疗组，MTT法检测药物IC50，通过细胞克隆形成率分析细胞存活状态，应用免疫荧光法观察H2Ax的形成。结果单药AG014699(≤10 μM)对Capan-1细胞有毒性作用，对Panc-1无效应；放疗联合药物组对Capan-1细胞克隆形成率影响最明显，与单药和单放疗组比较(P<0.05),而该差异在Panc-1细胞中不明显(P>0.05)；DNA损伤表现为H2Ax形式，提示DNA双链断裂是细胞死亡的主要模式。结论AG014699 对含有BRCA2基因缺陷的胰腺癌细胞Capan-1有放疗增敏作用。

【关键词】胰腺肿瘤；放射增敏；PARP抑制剂；DNA修复

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.10.005

中图分类号：R73-36

收稿日期(2015-02-23修回日期 2015-06-17)

Poly(ADP-ribose)Polymerase Inhibitor AG014699 Increase Sensitivity to Radiation in Pancreatic Cancer Cells with BRCA2 Mutation

XIEJianguo,ZHONGRui,WANAiping,etal.JiangxiCancerHospital,Nanchang,330029

Abstract【】ObjectiveTo investigate radiosensitization mechanism of AG014699 in BRCA2 deficient pancreatic cancer cells.MethodsPancreatic cancer cells lines were used,including Capan-1 with mutuated BRCA-2 and Panc-1 with BRCA1/2 wild type.Cell were treated AG014699 and /or radiotherapy (4～10 Gy) then the capability to proliferate was evaluated by colony formation,cell counting and MTT assays.Flow Cytometry were utilized to assess cell respone to AG014699 plus irradiation.ResultsAG014699 (≤ 10 μM)was cytotoxic to Capan-1 cell with mutuated BRCA-2 but not to Panc-1 cell without BRCA1/2 mutations.AG014699 indued DNA double-strand break in Capan-1 cell.Combination treatment with AG014699 plus radiotherapy was more effective than drug alone.ConclusionThe rationale of using a PARP inhibitor as radiosensitizer in pancreatic cancer with BRCA2 mutation has been demonstrated.

【Key words】Pancreatic cancer;Radiosensitivity;PARP inhibitor;DNA repair

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:1439～1442)

胰腺癌是1种早期临床症状不典型、进展快及预后较差的恶性消化肿瘤，由于早期症状不明显,80%以上胰腺癌诊断时已无法切除，其中50%～60%为局部晚期胰腺癌[1]。同步放化疗是局部晚期胰腺癌的主要治疗手段，尤其以健择为基础的同步放化疗可提高中位生存期[2],但平均中位生存期仅为9～10个月。因此,寻求新的治疗策略对胰腺癌的临床治疗具有重要意义。而癌细胞可以通过PARP酶及同源重组来修复基因毒性损伤而引起的单链及双链的断裂。本研究通过体外实验研究观察PARP抑制剂AG014699能否增加BRCA2缺陷的胰腺癌的放疗敏感性，并可能探讨其放疗增敏的分子机制。

1材料与方法

1.1细胞株

人胰腺癌细胞株CAPAN-1购自中国医学科学院肿瘤医院肿瘤细胞库。人胰腺癌细胞PANC-1购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2主要试剂与仪器

Rucaparib(AG-014699)(美国selleck);RPMI1640、DMEM高糖液体培养基(hyclone)；胎牛血清(北京全式金生物技术有限公司)；Histone H2AX Antibody(美国ANBO);荧光标记二抗(FITC)羊抗兔IgG、DAPI染色液(武汉博士德生物工程有限公司)；姬姆萨染液(北京索莱宝科技有限公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、DMSO(sigma)。

1.3方法

1.3.1细胞培养将购买的已复苏的人胰腺癌细胞Capan-1(含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 mg/L链霉素的1640培养液)置于5%CO2、37 ℃的培养箱中培养。待细胞增殖到80%～90%时可进行消化、离心、传代。取对数生长期细胞进行实验。

1.3.2MTT检测细胞增殖情况分别取对数期胰腺癌细胞Capan-1，以10 000个/孔细胞接种于96孔培养板中，每组设置5个复孔，过夜12 h后分别换为含有不同药物梯度的Rucaparib(AG-014699)(0 mmol/L、2.5 mmol/L、5.0 mmol/L、7.5 mmol/L、10.0 mmol/L、20.0 mmol/L、30.0 mmol/L)，并设置空白对照组及阴性对照组。后置于5%CO2、37 ℃的培养箱中分别培养24 h、48 h及72 h，加入MTT(5 mg/ml)20 μl/孔，继续培养4 h,弃上清，加入DMSO100 μl/孔。后在水平摇床上摇动10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570 nm处测量各孔的吸光值。抑制率(%)=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。

1.3.3细胞克隆形成率取对数生长期的胰腺癌细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞在培养液中备用。对照组、单纯药物组、单纯放疗组、放疗加药物组以每皿100、250、500、1 000、1 500、2 000个细胞的梯度密度分别接种于6cm含培养液的皿中，摇匀并使细胞分散均匀，含药组加入10 μmmol/L的Rucaparib(AG-014699)，置于5%CO2、37 ℃的培养箱中培养。药物作用6 h后，上述细胞梯度密度分别照射0、1、2、4、6、8 Gy(采用Elekta 公司Precise 直线加速器，6-MeV 电子线照射，SSD 为100 cm,单次照射，加用0.5cm 硅胶组织补偿)，继续培养12 天，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，PBS浸洗、甲醇固定、Giemsa染色、流水缓洗染色液、空气干燥。在显微镜(低倍镜)计数大于50个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率(%)= 克隆数/接种细胞数×100%。

1.3.4免疫荧光观察有丝分裂危像取对数生长期胰腺癌细胞，消化、离心并以40 000个/孔细胞接种到24孔板中，并加入10 μmmol/L的Rucaparib(AG-014699)，药物作用6 h后给与放疗加药物组细胞2 Gy的照射剂量，继续培养24 h,后经PBS冲洗、4%多聚甲醛固定、PBS浸洗、0.5%Triton X-100通透20 min，PBS浸洗，正常山羊血清室温封闭30 min，滴加足量稀释好的一抗Histone H2AX Antibody并放入湿盒，4 ℃孵育过夜，次日早上加荧光二抗(FITC)羊抗兔IgG，湿盒中20 ℃～37 ℃孵育1 h,滴加DAPI避光孵育5 min，后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.4统计学分析

所有数据均应用SPASS 19.0软件进行统计学分析，以(均数±标准差)表示计量资料，计数资料采用χ2检验，P<0.05为有统计学差异。

2结果

2.1MTT结果

在不同时间点24 h、48 h、72 h对2种胰腺癌细胞给予不同药物浓度的Rucaparib(AG-014699)药物，实验中发现CAPAN随着药物浓度的增加及作用时间的延长而细胞增殖抑制增强，细胞CAPAN-1在48 h细胞增殖抑制较明显，其IC50值为10 μmol/L，见图1。

图1　不同药物浓度及作用时间对细胞增殖抑制影响

2.2细胞克隆分子实验结果

放疗联合药物组对胰腺癌细胞Capan-1细胞克隆形成率影响最明显，与单药和单放疗组比较(P<0.05),细胞CAPAN-1通过细胞克隆分子实验发现PARP抑制剂可增强放射治疗的敏感性。

2.3细胞免疫荧光结果

单纯放疗(2 Gy)和药物联合照射(2 Gy)24 h后,药物联合放疗组细胞有丝分裂危象较单纯放疗组增加(P<0.05)。

3讨论

胰腺癌是临床常见的1种消化道恶性肿瘤，预后也较差，由于胰腺癌位于腹膜后，位置较深，早期临床症状比较隐匿，临床诊断和治疗也较为棘手，大部分患者诊断时已为局部晚期而丧失手术机会，5年总生存率不足5%。放射治疗是胰腺癌综合治疗中的重要方法之一，可增加手术切除的可能，并改善患者预后。临床上胰腺癌患者对放射治疗的敏感性存在差异，与其自身生物学特点有关。胰腺癌是低血供肿瘤，乏氧环境生长，对放射治疗不敏感，而提高放疗剂量将引起相关并发症发生率的增加，少数患者可引起治疗中断[3]。临床上多采用多种药物联合放疗以提高其放疗敏感性。

放射治疗是通过电离辐射至DNA 双链断裂而引起致死性损伤事件，其作用靶点是DNA 链，有些细胞受照射后DNA 单链断裂，后通过多种DNA 修复途径复活,故凡能抑制DNA 损伤修复的药物，均有可能使单链断裂发展至双链断裂，从而提高放射治疗的杀伤效应，即放射增敏剂。1946年，遗传学家Dobzhansky 等[4]首次提出“合成致死”理论：两种非致死的遗传变异单独发生时对细胞无影响，但同时发生在一个细胞内可致细胞死亡。利用聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂治疗含BRCA1/BRCA2 突变体肿瘤的“合成致死”模式是目前国际上该领域的研究热点[5-6]。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)是存在于多数真核细胞中的一个多功能蛋白质翻译后修饰酶。PARP 家族由18种蛋白酶组成，分别参与DNA修复、基因转录、稳定遗传、细胞周期和细胞死亡等多种生物学功能[7]。BRCA1/BRCA2 基因编码的蛋白质参与细胞通路和DNA损伤修复等功能。BRCA1可调节细胞周期检测点和发现DNA 修复并募集修复酶；而BRCA2 直接将DNA 修复蛋白RAD51直接易位到DNA损伤区域进行修复[8-9]。流行病学调查发现胰腺癌，尤其是家族性胰腺癌，多数携带BRCA2 突变基因[10-12],位于乳腺癌和卵巢癌之后。PARP抑制剂是与DNA 损伤修复有关的一类小分子靶向药物，是否能提高放射治疗的敏感性呢？Khan 等[13]探索PARP抑制剂GPI-15427 联合放疗的效应，发现GPI-15427 可提高头颈部鳞状细胞癌JHU006 和JHU012 的放射敏感性，DNA双链断裂明显增多。Efimova 等[14]发现PARP 抑制剂ABT-888 联合放疗可延长放疗对BRCA1/BRCA2 缺陷的乳腺癌细胞的杀伤作用，并加速细胞衰老。Kaye 等[15]开展一项多中心、开放式的随机II 期临床研究，比较PARP 抑制剂AZD2281 和阿霉素脂质体对卵巢癌的疗效，97例复发或证实有BRCA1/2 突变的卵巢癌入组，结果显示口服AZD2281 200 mg/次和400 mg/次，每天2 次的患者与阿霉素组相比，无进展生存率(PFS)无统计学上差异，而400mg/次的AZD2281 组的药物毒性可耐受，提示AZD2281 是1种低毒高效型的药物。Jacob 等[16]比较PARP 抑制剂3-ABA 联合化疗药物健择与单独健择对胰腺癌细胞的杀伤效应，发现联合用药对细胞毒性更大，诱导细胞凋亡增多，体内实验显示肿瘤体积缩小，小鼠存活时间较对照组延长40 天以上。Gottipati 等[17]发现PARP 抑制剂对BRCA2 缺陷的胰腺癌细胞系CAPAN-1 有较强的抑制作用。Letizia 等[18]比较PARP抑制剂联合放疗较单纯放疗作用于胰腺癌细胞CAPAN-1，通过细胞克隆分子实验发现PARP抑制剂可提高放疗的敏感性，其联合放化疗较放化疗可增加胰腺癌CAPAN-1、MiapaCa-2、AsPC-1、Panc-1细胞增殖抑制效应。

本次研究结果显示：不同时间点24 h、48 h、72 h对两种胰腺癌细胞CAPAN-1给予不同药物梯度的Rucaparib(AG-014699)药物，实验中发现CAPAN随着药物浓度的增加及作用时间的延长而细胞增殖抑制增强，测得细胞CAPAN-1在48时细胞增殖抑制较明显，其IC50值在10 μmol/L值。胰腺癌细胞CAPAN-1通过细胞克隆分子实验发现PARP抑制剂可增加放射治疗的敏感性。单纯放疗(2 Gy)和药物联合照射(2 Gy)后24 h,药物加放疗组中细胞有丝分裂危象较单纯放疗增加，与上述Letizia P等学者研究相一致[18]。

综上所述，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂AG014699可提高BRCA2缺陷的胰腺癌细胞放射敏感性，值得更多基础研究，进一步推广及应用到临床中。

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(编辑：吴小红)