马齿苋黄酮类化合物抑菌机理的研究

（西安工程大学环境与化学工程学院，陕西西安710048）

研究发现，马齿苋黄酮类化合物具有很高的抑菌活性，不仅可将其应用在药品、保健品、绿色产品上，还可以加工成防腐剂应用于食品的防腐保鲜上［1－3］，但目前对其抑菌机理的研究甚少。因此，研究其抑菌机理对马齿苋天然资源的开发利用意义重大［4］。

目前，国内外关于黄酮类化合物抑菌机理的观点有：Could提出，类黄酮可破坏微生物细胞壁及细胞膜的完整性，导致细胞内容物外渗，影响其新陈代谢，进而抑制微生物的生长［5］；Ulanowska 等［6］研究了金雀异黄酮对细菌细胞的影响，发现加入类黄酮抑制了细菌细胞DNA 和RNA 的合成，进而影响蛋白质合成；韩淑琴等［7］发现，仙人掌醇提物对微生物的菌体结构造成破坏，使菌体扭曲变形，导致细胞壁破裂，内容物外渗，达到抑菌效果。以上关于黄酮类化合物的抑菌机理都只是一种假定设想，没有详实的实验证实。

鉴于此，作者将马齿苋黄酮类化合物作用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌，采用滤纸片法测定其抑菌效果，通过测定菌液中还原糖含量、可溶性蛋白质含量和电导率的变化情况，研究马齿苋黄酮类化合物的抑菌机理，为开发更安全、高效的天然食品防腐剂提供帮助。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

马齿苋，采自西安市市郊；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌，陕西省微生物研究所提供。

葡萄糖、牛血清白蛋白、硫酸铜、次甲基蓝、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、氢氧化钠、考马斯亮蓝G－250、Tris试剂、磷酸等均为分析纯。

XS－04型多功能粉碎机，上海兆申科技有限公司；101型电热鼓风干燥箱，北京科伟永兴仪器公司；HIRAYAMA 型高压蒸汽灭菌锅，浙江科通仪器有限公司；752N 型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；PYX－DHS－50×65型隔水电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；W2010型电热恒温水浴锅，上海申顺生物科技有限公司；SW－CJ－1B（U）型单人单面超净工作台，苏州净化设备有限公司；DDS－11AT 型数字电导率仪，上海雷磁新泾仪器有限公司；Eppendorf Centrifuge 5810R 型高速离心机，德国艾本德股份公司。

1.2 方法

1.2.1 马齿苋黄酮类化合物的提取

除去马齿苋残根杂质，洗净，自然阴干后置于65 ℃烘箱中烘干，取出后用多功能粉碎机粉碎，过60目筛，备用。

精确称取一定量马齿苋粉用乙醇溶解，超声波辅助提取得到马齿苋黄酮类化合物提取液，再经DHP－600大孔吸附树脂纯化［8］，得到的马齿苋黄酮类化合物置于棕色收集瓶中，于4 ℃冰箱保存，备用。

1.2.2 抑菌实验

1.2.2.1 抑菌效果的测定

采用滤纸片法进行测定：用移液管吸取0.2 mL菌悬液，轻轻吹于含有固体培养基的培养皿中，再用无菌涂布棒将菌悬液涂抹均匀。用无菌镊子夹取充分蘸有马齿苋黄酮类化合物的无菌滤纸片（直径6 mm），沥干后轻轻均匀贴在固体培养基表面，以蘸有乙醇溶液的滤纸片作为空白对照。

将培养皿置于恒温培养箱培养，观察抑菌效果，测量抑菌圈直径，每组重复测3次，取平均值。

1.2.2.2 最低抑菌浓度（MIC）的测定

将纯化后的马齿苋黄酮类化合物用倍比稀释法稀释成不同浓度，分别用1 mL 无菌移液管移取0.5 mL，浸泡灭菌的滤纸片，摇匀，静置一段时间后取出，置于涂有菌悬液的固体培养基上，分散均匀，然后将培养皿置于恒温培养箱中培养一段时间后取出，观察抑菌效果，测量抑菌圈直径。无抑菌圈的浓度即为最低抑菌浓度［9］。

1.2.3 还原糖含量的测定

用无菌水调节菌悬液浓度为1×109CFU·mL－1左右。吸取0.2mL 菌悬液置于液体培养基中，加入不同浓度的马齿苋黄酮类化合物，在恒温培养箱中培养，每隔1h取出，7 000r·min－1离心10min，去除上清液，按照葡萄糖测定方法测定菌液中还原糖含量［10－11］。葡萄糖标准曲线方程为：c＝1.8939A＋0.0164，R2＝0.9909，还原糖含量计算公式如下：

式中：c为由标准曲线方程求得的还原糖质量，mg；V为提取液的体积，mL；a为显色时吸取样品液体积，mL；w为样品质量，g。

1.2.4 可溶性蛋白质含量的测定

用无菌水调节菌悬液浓度为1×109CFU·mL－1左右。吸取10mL菌悬液置于液体培养基中，加入不同浓度的马齿苋黄酮类化合物，摇匀，分别在恒温培养箱中培养静置0.5h、1h、2h、6h、12h、24h和36h，以经70%乙醇处理的作为对照组。离心后收集菌液，经0.01mol·L－1pH 值7.0～8.0的Tris－HCl溶液处理，按照牛血清白蛋白（BSA）测定方法测定可溶性蛋白质含量。BSA 标准曲线方程为：c＝0.1257A＋0.0007，R2＝0.9942，可溶性蛋白质含量计算公式如下：

式中：m′为从标准曲线上查得的蛋白质质量，mg；V为样品提取液总体积，mL；VS为测定时所取样品提取液体积，mL；m为样品质量，g。

1.2.5 电导率的测定

用无菌水调节菌悬液浓度为1×109CFU·mL－1左右。吸取10mL菌悬液置于液体培养基中，加入不同浓度的马齿苋黄酮类化合物，振荡摇匀。分别测定0 min、10 min、20 min、40 min、70 min、100 min、180 min时的电导率，每组重复3次，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 马齿苋黄酮类化合物的抑菌效果

马齿苋黄酮类化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌的抑菌效果见图1，最低抑菌浓度见表1。

图1 马齿苋黄酮类化合物对大肠杆菌（a）、金黄色葡萄球菌（b）、酵母菌（c）的抑菌效果Fig.1 Antibacterial efficiency of flavonoids from purslane against Escherichia coli（a），Staphylococcus aureus（b），Saccharomycetes（c）

由图1和表1可知，马齿苋黄酮类化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌等均有一定的抑制作用，其浓度越高，抑菌圈直径越大，抑菌效果越明显；其中对大肠杆菌和酵母菌有较强的抑制作用，最低抑菌浓度均为0.313 mg·mL－1，对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，最低抑菌浓度为0.156mg·mL－1。

表1 马齿苋黄酮类化合物的最低抑菌浓度Tab.1 The minimum inhibition concentration of flavonoids from purslane

2.2 抗菌机理研究

2.2.1 马齿苋黄酮类化合物对菌液中还原糖含量的影响（图2）

图2 马齿苋黄酮类化合物对大肠杆菌（a）、金黄色葡萄球菌（b）、酵母菌（c）菌液中还原糖含量的影响Fig.2 Effect of flavonoids from purslane on reducing sugar content of bacteria liquid of Escherichia coli（a），Staphylococcus aureus（b），Saccharomycetes（c）

由图2可知，菌液中还原糖含量均随马齿苋黄酮类化合物浓度的增大而显著增加，表明菌体可能受到抑菌成分的破坏［12］，导致体内还原糖渗出，使菌液中还原糖含量增加；在马齿苋黄酮类化合物浓度为100 mg·mL－1时，大肠杆菌、酵母菌在抑菌成分作用3h、金黄色葡萄球菌在抑菌成分作用2h时，菌液中还原糖含量达到最多，之后，还原糖含量逐渐减少，可能是菌液中存活菌的呼吸作用消耗了部分还原糖所致。

2.2.2 马齿苋黄酮类化合物对菌液中可溶性蛋白质含量的影响（图3）

图3 马齿苋黄酮类化合物对大肠杆菌（a）、金黄色葡萄球菌（b）、酵母菌（c）菌液中可溶性蛋白质含量的影响Fig.3 Effect of flavonoids from purslane on soluble protein content of bacteria liquid of Escherichia coli（a），Staphylococcus aureus（b），Saccharomycetes（c）

由图3可知，菌液中蛋白质含量随马齿苋黄酮类化合物浓度的增大而增加，表明菌体可能受到抑菌成分的破坏，导致体内可溶性蛋白质外渗，使得菌液中可溶性蛋白质含量增加；随着抑菌成分作用时间的延长，菌液中可溶性蛋白质含量逐渐减少，可能是存活的少量菌生长，消耗了菌液中的部分蛋白质，也可能是细菌细胞膜自身修复功能，使得胞内蛋白质外渗减少，菌液中可溶性蛋白质含量相应减少［13］。

2.2.3 马齿苋黄酮类化合物对菌液电导率的影响（图4）

由图4可知，抑菌成分作用10min时，各菌液的电导率显著上升，且随马齿苋黄酮类化合物浓度的增大而升高；10 min后，电导率没有明显变化。表明马齿苋黄酮类化合物作用10min时就使菌体细胞内容物渗出，阻止细胞继续生长从而达到抑菌目的。

图4 马齿苋黄酮类化合物对大肠杆菌（a）、金黄色葡萄球菌（b）、酵母菌（c）菌液电导率的影响Fig.4 Effect of flavonoids from purslane on conductivity of bacteria liquid of Escherichia coli（a），Staphylococcus aureus（b），Saccharomycetes（c）

3 结论

马齿苋黄酮类化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌均有一定的抑制作用，且随着浓度的增大抑菌效果明显增强。相同浓度下，马齿苋黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。马齿苋黄酮类化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌菌液中还原糖含量、可溶性蛋白质含量和电导率均有一定的影响，且随浓度的增大还原糖含量、可溶性蛋白质含量和电导率的变化越显著，其中对金黄色葡萄球菌的影响最明显。由此推断马齿苋黄酮类化合物的抑菌机理主要是破坏了细菌的细胞膜，使其内容物外渗，从而达到抑菌目的。

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