WIF-1、DKK基因启动子甲基化对COLO 320、HT-29细胞株β-catenin磷酸化的影响

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(南华大学附属第一医院消化内科，湖南 衡阳 421001)

·基础医学·

WIF-1、DKK基因启动子甲基化对COLO 320、HT-29细胞株β-catenin磷酸化的影响

周徽，胡光胜，曾斌，廖爱军

(南华大学附属第一医院消化内科，湖南 衡阳 421001)

目的探讨Wnt抑制性基因甲基化对结直肠癌细胞株Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法使用甲基特异性PCR和逆转录实时定量PCR方法，分别检测结直肠癌细胞株COLO 320、HT-29及正常细胞株CCD-18Co中WIF-1、DKK-1、DKK-3的启动子CpG岛甲基化、mRNA水平，和测定β-catenin蛋白磷酸化情况，并观察5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-dC)去甲基化对各指标的影响。结果COLO 320细胞的DKK-1及DKK-3 mRNA水平明显降低、甲基化程度高；HT-29细胞的DKK-3、WIF-1 mRNA水平低、甲基化程度高；两个肿瘤细胞株的β-catenin蛋白总量均明显增高，且主要为非磷酸化的状态。5-aza-dC可减少这些指标的改变。结论抑制性基因甲基化调节的Wnt/β-catenin通路的异常激活，可能在结直肠癌的形成中有重要作用。在不同的肿瘤细胞株之间、不同Wnt抑制基因的甲基化程度存在差异；该领域的深入研究有助于开发出新的治疗药物。

Wnt/β-catenin信号通路； 甲基化； 结直肠癌； 表观遗传学

Wnt信号通路在多细胞生物中高度保守，在胚胎发育、内环境自稳和肿瘤发生等多种生物学过程中发挥着重要的调控作用。例如，经典的Wnt/β-catenin信号通路的异常激活是大多数结直肠癌的早期事件，其中约80%患者携带有导致APC(adenomatous polyposis coli)基因功能缺失的突变，5%携带有引起β-catenin活化的突变[1- 2]。Wnt/β-catenin信号通路还是肿瘤维持和转移所必需的[3]。

在Wnt/β-catenin信号通路的上游，Wnt拮抗物的失活与肿瘤的发生密切相关。Wnt的拮抗物主要有两大类：能直接结合Wnt蛋白、抑制Wnt/β-catenin通路活性的WIF-1(Wnt抑制因子-1)、sFRP家族等；以及能结合Wnt受体复合物中的低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6(LRP 5/LRP 6)的DKK(Dickkopfs)家族。已证明WIF-1[4]、sFRP[5]和DKK[6]的表观遗传学改变以及表达异常与消化道肿瘤密切相关。本文则着重观察在不同结直肠癌细胞株中，WIF-1与DKK基因启动子的甲基化、mRNA及蛋白的水平，及其对β-catenin水平的影响。

1 材料与方法

1.1细胞系结直肠腺癌细胞系COLO 320、HT-29均购自中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市)：正常的结直肠细胞株CCD-18Co(CRL-1459)购自美国ATCC。细胞培养基为10%胎牛血清的DMEM。

1.2去甲基化处理收集对数增长期的培养细胞,使用5 μmol/L 的5-氮杂-2′-脱氧胞嘧啶核苷 (5-aza-2′-deoxycytidine，5-aza-dC，Sigma-Aldrich) 孵育72 h以进行去甲基化处理。处理结束后立即收集细胞提取RNA进行检测。

1.3 RNA的提取、逆转录和WIF-1、DKK的实时荧光RT-PCR定量检测每个样品使用约106个细胞，使用QIAamp RNA mini kit (Qiagen)按说明提取总RNA；使用SuperScript Ⅲ及随机引物进行逆转录；使用TaqMan universal PCR master mix(Applied Biosystems)，按说明书及参照文献[7]，对以下基因进行实时荧光RT-PCR定量检测。DKK-1(TaqMan Gene Expression Assay)；DKK-3(正向引物：5′-GTA AGT TTC CCC TCT GGC TTG-3′,反向引物：5′-AAG CAC CAG ACT GTG AAG CCT-3′，探针：FAM-5′- AGG TGT TGT GCA TTT GTT CAG CTC CC-3′-TAMRA)；WIF-1(正向引物：5′-TCC AAA CAC CTC AAA ATG CTA TC-3′，反向引物：5′-GAA CCC ATC AGG ACA CTC GC-3′，探针：FAM-5′-ACA AGC TGA GTG CCC AGG CGG-3′-TAMRA)和内参GAPDH(正向引物：5′-CCA CTC CTC CAC CTT TGA C-3′,反向引物：5′-ACC CTG TTG CTG TAG CCA-3′，探针：FAM-5′-TTG CCC TCA ACG ACC ACT TTG TC-3′-TAMRA)。使用ABI 7500进行检测，反应条件为：95 ℃ 10 min和35 个周期的95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s。每个样品测3个重复孔。数据分析时参考文献[8]，计算靶基因与GAPDH 参照基因Ct值的比值。

1.4 DNA的提取和甲基化特异PCR(MSP)检测

采用QIAamp DNA mini kit (Qiagen) 提取、纯化培养的肠癌细胞和正常细胞CCD-18Co的DNA。按文献方法[9]使用亚硫酸氢盐对DNA进行修饰并进行MSP检测。引物序列参照文献[6,9]分别为：

甲基化特异的引物：DKK-1： 5′-CGT TCG TTG GTA GTT TTT ATT TCG A-3′ (正向)； 5′-GCG ACT ACC TTT ATA CCG CGA A-3′(反向)；DKK-3： 5′-CGG TTT TTT TTC GTT TTC GGG-3′(正向)，5′-CAA ACC GCT ACA TCT CCG CT-3′(反向)；WIF-1：5′-GGG CGT TTT ATT GGG CGT AT-3′(正向)，5′-AAA CCA ACA ATC AAC GAA C-3′ (反向)。

非甲基化的特异引物为:DKK-1：5′-TGT TTG TTG GTA GTT TTT ATT TTG A-3′，5′-ACC ACA ACT ACC TTT ATA CCA CAA A-3′；DKK-3：5′-TTT TGG TTT TTT TTT GTT TTT GGG-3′；5′ -CCA AAC CAC TAC ATC TCC ACT-3′；WIF-1：5′-GGG TGT TTT ATT GGG TGT AT-3′(forward)，5′-AAA CCA ACA ATC AAC AAA AC-3′(reverse) 。主要步骤为：PCR 反应条件：94 ℃预变性 12 min：94 ℃变性 1 min，退火 45 s，72 ℃延伸 40 s，40个循环后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。使用正常人外周血单个核细胞(PBMC)提取的DNA经SssI甲基化酶处理后作为甲基化分析的阳性对照，未经处理的作为非甲基化的阴性对照。 甲基化(M)和非甲基化(U)特异PCR的产物电泳后，使用TANON GIS凝胶成像分析系统进行半定量分析，计算其光密度的相对比例。

1.5 β-catenin的Westernblot检测将106细胞直接以收集细胞加入裂解液裂解后收集上清，以BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度后,将蛋白进行SDS-PAGE 电泳分离,并转移至PVDF 膜(Immobilon-P,Millipore)上，采用5%脱脂奶粉室温封闭3 h，进行抗体标记。 所用抗体为小鼠anti-β-catenin (BD Transduction Laboratories)、小鼠anti-Actin (Sigma)、兔多克隆抗人DKK-1、DKK-3、WIF-1(Abcam)和兔抗人磷酸化β-catenin (pS33/pS37/pT41) (Cell Signalling Technologies)，以及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、兔抗小鼠IgG(Abcam)。使用ECL Western blotting 检测试剂 (Pierce)进行显色及VersaDoc MP4000 (Bio-rad)进行分析。

1.6统计分析使用IBM SPSS version 20.0进行统计分析。组间比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同细胞株中WIF-1、DKK-1、DKK-3 mRNA表达的改变根据不同靶基因对GAPDH基因的比值，以正常细胞CCD-18Co为参照，计算出COLO320和HT-29不同基因的改变倍数。图1可以看出COLO320细胞的DKK-1和DKK-3 mRNA表达明显下降(P<0.01)；而WIF-1改变不明显。而HT-29细胞的DKK-3 和WIF-1 mRNA水平明显下降(P<0.01)，DKK-1改变不明显。而经5-aza-dC干预后，均有所回调，但依然明显低于正常细胞。

2.2不同细胞株中WIF-1、DKK-1、DKK-3启动子甲基化程度的检测使用甲基化特异PCR以及非甲基化特异PCR进行检测发现，CCD-18Co的WIF-1、DKK-1、DKK-3等3个基因启动子均处于非甲基化状态；COLO320的DKK-1和DKK-3基因启动子处于高度甲基化、WIF-1处于非甲基化状态；而HT-29的DKK-3和WIF-1基因启动子处于高度甲基化，DKK-1处于非甲基化状态。

图1 不同细胞株中WIF-1、DKK-1、DKK-3 mRNA表达的改变 注：相对于未经5-aza-dC处理的CCD-18Co细胞株(标化为“1”)，DKK-1(A)、DKK-3(B)和WIF-1(C)mRNA在COLO320、HT-29细胞中表达的水平及经5-aza-dC处理后改变的倍数

经5-aza-dC干预后，CCD-18Co的3个基因依然保持于非甲基化的状态；而COLO320高甲基化的DKK-1、DKK-3均明显减弱，并扩增出了部分未甲基化的条带。相似的，HT-29高甲基化的DKK-3和WIF-1在5-aza-dC干预后，也出现了MSP条带减弱、并扩增出了非甲基化的条带(图2)。

2.3不同细胞株中DKK-1、DKK-3和WIF-1蛋白的表达使用Western Blot对不同细胞株DKK-1、DKK-3和WIF-1蛋白的表达水平进行分析，研究发现，CCD-18Co的DKK-1、DKK-3和WIF-1蛋白均处于较高表达水平，5-aza-dC处理后无明显改变。COLO 320 表达DKK-1和WIF-1微弱；5-aza-dC处理后DKK-1明显增强、WIF-1也略有增加但依然处于极低水平。DKK-3则始终有较高表达。而HT-29的DKK-1表达处于较高水平，DKK-3和WIF-1表达微弱，5-aza-dC处理后略有增加(图3)。

图2 不同细胞株中WIF-1、DKK-1、DKK-3 基因甲基化的状态 注：M：甲基化特异PCR。U：非甲基化特异PCR。“+”为5-aza-dC处理组；“-”为未处理组。Control为阳性对照(M.DNA：甲基化的DNA)和阴性对照(PBMC：正常人PBMC提取的 DNA)

图3 不同细胞株中DKK-1、DKK-3和WIF-1蛋白的表达水平 注：“+”为5-aza-dC处理组；“-”为未处理组

2.4 β-catenin含量分析Wnt/β-catenin的异常活化最终体现为β-catenin的磷酸化减少、以及随后的泛素化降解减少。而在本文中相对于CCD-18Co细胞，COLO320和HT-29细胞都存在β-catenin总量增高、且Ser33/37和Thr41磷酸化β-catenin水平低的情况，提示非磷酸化的β-catenin增高。而经5-aza-dC干预后，COLO320和HT-29细胞β-catenin总量均降低、磷酸化β-catenin含量升高(图4)。

3 讨 论

Wnt信号经典通路——Wnt/β-catenin通路在多个重要的生物学过程中发挥着重要的调控作用。Wnt/β-catenin通路主要为：在存在Wnt活化信号时，Wnt结合至其受体frizzled(Fzd)和LRP 5/LRP 6，阻止了β-catenin被AXIN/ APC/ GSK3/ CK1复合体磷酸化、进而被泛素化及蛋白酶体降解。因此，

图4 不同细胞株中β-catenin和磷酸化-β-catenin的水平注：“+”为5-aza-dC处理组；“-”为未处理组

β-catenin在胞质中聚集、并转位进入细胞核，作为转录因子TCF/LEF家族的辅因子，导致多个Wnt/β-catenin靶基因的转录，如Axin2、Smad7、Ccnd1/CyclinD和Myc等。因此，如能影响Wnt抑制因子的表达，则可能在Wnt/β-catenin通路上游抑制该通路的激活，产生包括抑制肿瘤生长、转移在内的广泛的调节作用。

基因的表观遗传学修饰是一种不依赖DNA序列改变的、可逆的基因表达调控过程。基因启动子甲基化等表观遗传学修饰与癌症的发生密切相关[10-11]。本研究则进一步证实，在结直肠癌细胞株COLO320及HT-29中，Wnt抑制基因的mRNA表达、基因启动子高度甲基化与相应的蛋白表达水平基本吻合。如COLO320的DKK-1和DKK-3 mRNA较低，其基因启动子也处于高甲基化状态，蛋白表达也相应较低。而HT-29中DKK-3和WIF-1的表达情况与之类似。同时，COLO320和HT-29的β-catenin总量均有所增加、磷酸化的β-catenin减少。

本研究的结果说明，这两个结直肠癌细胞株中，均存在Wnt抑制基因的甲基化修饰异常、以及Wnt/β-catenin通路异常活化。这一改变可能参与了结直肠癌的形成。因此，已有研究尝试以粪便检查SFRP1和WIF-1基因甲基化的程度来帮助筛查肠癌[12]。本研究还发现，在COLO320、HT-29这两个不同的结直肠癌细胞珠中，不同Wnt抑制基因的甲基化和转录水平是存在差异的；而去甲基化处理可以部分下调Wnt/β-catenin通路的异常活化。提示该通路可能成为新的结直肠癌的治疗靶点。

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HypermethylationofWIF-1andDKKGeneFamilyontheβ-cateninPhosphorylationinColorectalAdenocarcinomaCellLinesCOLO320andHT-29

ZHOU Hui,HU Guangsheng,ZENG Bin,et al

(DepartmentofDigestion,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo reveal the the effect of methylated inhibitory genes on Wnt/β-catenin pathway in colorectal adenocarcinoma cell lines.MethodsWith colorectal adenocarcinoma cell lines COLO 320,HT-29 and normal colorectal cell line cCCD-18Co,methylation status of CpG island in promotor of WIF-1,DKK-1 and DKK-3 genes were determined by methylation specific PCR (MSP),and mRNA levels of these genes were quantified by real-time RT-PCR,and phosphorylated β-catenin were semi-quantified by Western blot.Effect of DNA-demethylating agent 5-aza-2′-deoxycytidine (5-aza-dC) treatment were also evaluated.ResultsDKK-1and DKK-3 mRNA decreased accompanied with hypermethylation status of the CpG islands in COLO 320,while DKK-3 and WIF-1 mRNA decreased accompanied with hypermethylation in HT-29.Total β-catenin increased significantly while phosphorylated β-catenin declined in both cell lines.5-aza-dC ameliorated these aberrant parameters partially.ConclusionThe aberrant activation of Wnt/β-catenin pathway mediated by the hypermethylation of WIF-1 and DKKs genes may contribute to the oncogenesis of colorectal adenocarcinoma,while the methylation level of different Wnt inhibitory genes varied in colorectal cancer cell lines.Further research on this field will prompt the development of new therapies targeting the methylation process.

WNT/β-catenin signaling pathway； hypermethylation； colorectal adenocarcinoma； epigenetics

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.04.006

2015-04-30；

2015-06-12

衡阳市科学技术局科技计划(编号：2011KJ64).

Q279

A

(此文编辑：蒋湘莲)